Cách tiến hành chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống trong phòng thí nghiệm với phương pháp Nested PCR như thế nào?

Nội dung chính

• Khi tôm sú giống có dấu hiệu mắc bệnh đốm trắng thì phải lấy mẫu thử với số lượng là bao nhiêu?
• Cách tiến hành chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống trong phòng thí nghiệm với phương pháp Nested PCR như thế nào?
• Những mẫu thuốc thử và vật liệu thử nào phù hợp dùng cho tôm sú giống khi có biểu hiện mắc bệnh đốm trắng?

Khi tôm sú giống có dấu hiệu mắc bệnh đốm trắng thì phải lấy mẫu thử với số lượng là bao nhiêu?

Theo tiểu mục 3.3. Mục 3 QCVN 02-34-1:2021/BNNPTNT về Giống tôm nước lợ, tôm biển - Phần 1: Tôm sú, tôm thẻ chân trắng quy định về số lượng mẫu thử phải lấy khi muốn tiến hành thử nghiệm tác nhân gây bệnh ở tôm như sau:

"3. PHƯƠNG PHÁP THỬ

3.1. Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị, dụng cụ trong Quy chuẩn này tham khảo tại Phụ lục 2.

3.2. Lấy mẫu kiểm tra chỉ tiêu kỹ thuật

3.2.1. Tôm bố mẹ

Dùng vợt (3.1.2) vớt tôm tại 5 vị trí (4 vị trí xung quanh và giữa) của dụng cụ chứa tôm. Số lượng tôm bố mẹ lấy mẫu để kiểm tra là 20 cá thể với tỷ lệ tôm đực và tôm cái là 1:1. Trường hợp ít hơn 20 cá thể thì lấy toàn bộ số tôm bố mẹ để kiểm tra.

3.2.2. Tôm giống

Dùng vợt (3.1.1) lấy ngẫu nhiên 100 cá thể đến 200 cá thể theo chiều thẳng đứng tại 5 vị trí (4 vị trí xung quanh và giữa) của dụng cụ chứa tôm.

3.3. Lấy mẫu kiểm tra tác nhân gây bệnh

3.3.1. Số lượng mẫu lấy để kiểm tra tác nhân gây bệnh được quy định trong Bảng 4:

3.3.2. Lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu

Theo QCVN 01- 83: 2011/BNNPTTN, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về bệnh động vật - Yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển, ban hành kèm theo Thông tư số 71/2011/TT-BNNPTNT ngày 25 tháng 10 năm 2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn."

Nếu tôm có dấu hiệu mắc bệnh đốm trắng thì thực hiện lấy số lượng mẫu thử theo bảng 4 tiểu mục 3.3.1 như trên. Tùy vào số lượng cá thể trong đàn mà bạn nuôi để căn cứ lấy số lượng mẫu thử tương ứng.

Cách tiến hành chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống trong phòng thí nghiệm với phương pháp Nested PCR như thế nào?

Cách tiến hành chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống trong phòng thí nghiệm với phương pháp Nested PCR như thế nào?

Theo tiểu mục 6.1 Mục 6 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về việc chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm của tôm như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp Nested PCR (Polymerase Chain Reaction)

6.1.4 Cách tiến hành

6.1.4.1 Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN của Qiagen: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) [1]) (xem phụ lục B1).

Hoặc Sử dụng kit tách chiết TACO RNA/ADN extraction Kít (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests) [2]) (xem phụ lục B2).

6.1.4.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp Nested PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 và 146F2/146R2 (3.2.1) để phát hiện vi rút đốm trắng. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.1.4.3 Tiến hành phản ứng Nested PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp nested PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước): Giai đoạn 1 (bước 1), thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1; Giai đoạn 2 (bước 2), thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi 146F2/146R2, sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục C).

6.1.4.4 Điện di

6.1.4.4.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.12) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.6) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.7) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain[3]) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.4.4.2 Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.8) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.6), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.10) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.10) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 25 min.

6.1.4.5 Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 941 bp.

Với điều kiện phản ứng trên:

Kết quả mẫu thử dương tính khi:

- Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 941 bp.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi:

- Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng"

Theo đó, nếu muốn tiến hành thử nghiệm trên mẫu tôm sú giống để tìm tác nhân gây bệnh đốm trắng thì anh tiến hành theo quy định trên đối với phương pháp tách chiết ADN.

Những mẫu thuốc thử và vật liệu thử nào phù hợp dùng cho tôm sú giống khi có biểu hiện mắc bệnh đốm trắng?

Theo Mục 3 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về thuốc thử và vật liệu thử ở tôm sú giống khi có biểu hiện bệnh như sau:

"3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1 Etanol, từ 96 % đến 100 % (C2H6O).

3.1.2 Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS).

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR và realtime PCR

3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.2 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò.

3.2.3 Kít tách chiết ADN (Xem B1 và B2)

3.2.4 Kít nhân gen PCR (PCR Master Mix Kit, Cat. No K0171).

3.2.5 Kít nhân gen Realtime PCR ( ví dụ: Kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017).

3.2.6 Dung dịch đệm TAE (Tris - acetate - EDTA) hoặc TBE (Tris - brorate - EDTA) (xem A.1).

3.2.7 Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.8 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X).

3.2.9 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.10 Thang chuẩn AND (Ladder).

3.2.11 Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.12 Agarose."

Anh căn cứ vào quy định trên để sử dụng đúng mẫu thuốc thử và vật liệu thử theo đúng tiêu chuẩn Việt Nam để có kết quả tốt nhất.