Cách tiến hành phương pháp lai tại chỗ nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm cần thực hiện như thế nào?

Nội dung chính

• Chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp lai tại chỗ được thực hiện theo nguyên tắc nào?
• Cần chuẩn bị thuốc thử và vật liệu thử nào khi thực hiện phương pháp lai tại chỗ để chẩn đoán bệnh ở tôm?
• Cách tiến hành phương pháp lai tại chỗ nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm cần thực hiện như thế nào?

Chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp lai tại chỗ được thực hiện theo nguyên tắc nào?

Theo tiết 3.2.3.1 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định nguyên tắc chẩn đoán bệnh bằng phương pháp lai tại chổ như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.3. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH)

3.2.3.1. Nguyên tắc

- Lai tại chỗ được phát triển từ phép lai Southern Blot.

Trình tự axit nucleic cần tìm không được tách chiết ra khỏi mô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân tử lai được thực hiện ngay trên khuẩn lạc, nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô.

Theo đó, khi thực hiện phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH) trình tự axit nucleic cần tìm không được tách chiết ra khỏi mô hay tế bào.

Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân tử lai được thực hiện ngay trên khuẩn lạc, nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô.

Cách tiến hành phương pháp lai tại chỗ nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm cần thực hiện như thế nào? (Hình từ Internet)

Cần chuẩn bị thuốc thử và vật liệu thử nào khi thực hiện phương pháp lai tại chỗ để chẩn đoán bệnh ở tôm?

Theo tiết 3.2.3.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định nguyên tắc chẩn đoán bệnh bằng phương pháp lai tại chổ như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.3. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH)

...

3.2.3.2. Thuốc thử và vật liệu thử

- Dung dịch lai.

- Phosphatase kiềm và nitroblue tetrazolium và 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphat.

Xem 3.2.2.1."

Dẫn chiếu tiết 3.2.2.1 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.2. Phương pháp mô học

3.2.2.1. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.

- Parafin.

- Xylen.

- Keo dán, ví dụ Bom Canada.

Như vậy, thuốc thử và vật liệu thử khi thực hiện phương pháp lai tại chỗ để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bao gồm:

- Dung dịch lai.

- Phosphatase kiềm và nitroblue tetrazolium và 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphat.

- Dung dịch Davidson.

- Thuốc nhuộm hematoxylin.

- Thuốc nhuộm eosin.

- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.

- Parafin.

- Xylen.

- Keo dán.

Cách tiến hành phương pháp lai tại chỗ nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm cần thực hiện như thế nào?

Theo tiết 3.2.3 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về các bước thực hiện phương pháp lai tại chỗ như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.3. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH)

...

3.2.3.4. Lấy mẫu

Thu những con tôm có dấu hiệu bị bệnh (như mô tả dấu hiệu bệnh lý phần trên).

Mẫu tôm dùng để phân tích phải còn sống hoặc đang còn trong tình trạng hấp hối.

3.2.3.5. Chuẩn bị mẫu

Để phát hiện IMNV thì mẫu tôm phải được cố định bằng cách cắt lấy phần cơ đuôi, cơ bụng ngâm trong dung dịch không axit [dung dịch R-F (A.4)].

Ngâm mẫu cố định từ 12 h đến 24 h, sau đó lấy mẫu ra khỏi dung dịch cố định, rửa với nước trong 1 h đến 2 h và đem xử lý mẫu.

3.2.3.6. Xử lý mẫu

Mẫu tôm cố định được xử lý và cố định trong parafin và cắt (4m) theo hướng dẫn trong quy trình chuẩn.

3.2.3.7. Tiến hành lai

Cặp probe sử dụng trong quá trình lai, xem bảng 7.

Quy trình sử dụng cho phương pháp ISH được mô tả bởi Lightner (1996).

Với phương pháp ISH, các mảnh cắt trên tiêu bản được phủ bởi 500 l dung dịch lai (4 SSC, formamid 50 %, 1 Denhard's, dextran sulfat 5 % (khối lượng/thể tích), DNA tinh dịch cá hồi 0,5 g/ml) có chứa IMNV probe (0,2 g/ml). Tiêu bản được đặt trên bản nhiệt ở 84 oC trong 10 min. Làm lạnh trong đá trong thời gian 2 min và ủ qua đêm trong lò lai ở 42 oC. Sự tạo màu được thực hiện với kháng thể kháng digoxigenin được gắn với phosphatase kiềm và nitroblue tetrazolium và 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphat. Đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học.

3.2.3.8. Đọc kết quả

Mẫu dương tính nếu có các thể vùi kết tủa màu xanh đến đen trong tế bào chất, những tế bào không bị nhiễm vi rút thì cấu trúc mô bình thường và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam).

Mẫu âm tính nếu không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung và có màu cam sau quá trình lai."

Theo đó, việc thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp lai tại chỗ được thực hiện theo các bước: lấy mẫu - chuẩn bị mẫu - tiếm hành lai và cuối cùng là đọc kết quả.

Nếu mẫu dương tính thì sẽ có các thể vùi kết tủa màu xanh đến đen trong tế bào chất, những tế bào không bị nhiễm vi rút thì cấu trúc mô bình thường và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam).

Nếu mẫu âm tính nếu thì sẽ không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung và có màu cam sau quá trình lai.