Cách tiến hành phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm được thực hiện như thế nào?

Nội dung chính

• Trường hợp tôm mắc bệnh hoại tử cơ thì người nuôi cần lưu ý những vấn đề nào?
• Để thực hiện phương pháp mô học để chẩn đoán tình trạng bệnh hoại tử cơ ở tôm thì cần chuẩn bị những gì?
• Cách tiến hành phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm được thực hiện như thế nào?

Trường hợp tôm mắc bệnh hoại tử cơ thì người nuôi cần lưu ý những vấn đề nào?

Theo tiểu mục 3.1 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về triệu chứng lâm sàng khi tôm mắc bệnh hoại tử cơ như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

3.1. Chẩn đoán lâm sàng

3.1.1. Dịch tễ học

Vi rút gây bệnh IMNV cảm nhiễm chủ yếu trên các tôm thuộc họ Tôm he (Penaeidae): Penaeus vannamei, Ρ.stylirostris, Ρ.monodon… gây tỉ lệ chết cao. Tỷ lệ tôm nhiễm bệnh trong ao, bể có thể lên đến 100 %, tỷ lệ gây chết khoảng 40 % đến 70 %.

Bệnh có thể lan truyền từ bố mẹ truyền vi rút gây bệnh cho con cái thông qua quá trình sinh sản. Hoặc bệnh lan truyền thông qua những sinh vật mang mầm bệnh vào vùng nuôi như chim ăn những con tôm bệnh hoặc tôm chết thải phân ra ngoài môi trường nuôi, thông qua kí chủ trung gian mang mầm bệnh vào ao bể nuôi, qua dùng chung dụng cụ, nguồn nước nhiễm bệnh.

Bệnh xuất hiện quanh năm, đặc biệt là mùa xuân và đầu hè khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ trong ngày biến thiên quá lớn, thay đổi độ mặn gây sốc cho tôm.

3.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn cấp tính của bệnh IMNV: cơ vân tôm vùng bụng kéo dọc đến phần đuôi bị hoại tử, có màu trắng đục. Tôm bơi lờ đờ, dạt bờ rồi chết. Tôm chết nhiều liên tiếp trong vài ngày, tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 40 % đến 70 % trong ao nhiễm.

CHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp, tôm bị stress do yếu tố môi trường hoặc tôm bị bệnh trắng đuôi cũng thể hiện dấu hiệu bệnh lý tương tự."

Theo đó, trong một số trường hợp, tôm bị stress do yếu tố môi trường hoặc tôm bị bệnh trắng đuôi cũng thể hiện dấu hiệu bệnh lý tương tự như mắc bệnh hoại tử cơ.

Bệnh có thể lan truyền từ bố mẹ truyền vi rút gây bệnh cho con cái thông qua quá trình sinh sản. Hoặc bệnh lan truyền thông qua những sinh vật mang mầm bệnh vào vùng nuôi như chim ăn những con tôm bệnh hoặc tôm chết thải phân ra ngoài môi trường nuôi, thông qua kí chủ trung gian mang mầm bệnh vào ao bể nuôi, qua dùng chung dụng cụ, nguồn nước nhiễm bệnh.

Khi phát hiện tôm có triệu chứng bệnh hoại tử cơ, người nuôi cần có những biện pháp hợp lý tách những cá thể bệnh để hạn chế việc lây lan bệnh.

Cách tiến hành phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm được thực hiện như thế nào? (Hình từ Internet)

Để thực hiện phương pháp mô học để chẩn đoán tình trạng bệnh hoại tử cơ ở tôm thì cần chuẩn bị những gì?

Theo tiết 3.2.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về thuốc thử, vật liệu thử, thiết bị dụng cụ cần thiết khi chẩn đoán như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.2. Phương pháp mô học

3.2.2.1. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.

- Parafin.

- Xylen.

- Keo dán, ví dụ Bom Canada.

3.2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Kính giải phẫu.

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen.

- Lọ nhỏ cố định mẫu.

- Bình rót parafin.

- Bộ phận làm lạnh mẫu.

- Máy cắt mẫu microtome.

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ.

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu.

- Kính hiển vi quang học.

- Cassete.

- Khung đúc mẫu.

Như vậy, khi tiến hành phương pháp mô học chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm thì cần chuẩn bị thuốc thử, vật liệu thử cũng như các thiết bị, dụng cụ theo Tiêu chuẩn vừa nêu trên.

Cách tiến hành phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm được thực hiện như thế nào?

Theo tiết 3.2.2.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về cách tiến hành phương pháp mô học chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.2. Phương pháp mô học

...

3.2.2.4. Cách tiến hành

3.2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu

Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Đối với ấu trùng hoặc tôm hậu ấu trùng có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt lấy phần cơ đuôi, cơ bụng, sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 1 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định

Ngâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

3.2.2.4.3. Làm trong mẫu

Ngâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 oC đến 58 oC trong 1 h.

Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

3.2.2.4.4. Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 m đến 5 m.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 oC đến 35 oC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và etanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %, etanol 90% và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

3.2.2.4.6. Đọc kết quả

Soi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1000 X)

Khi tôm bị bệnh IMNV, kết quả mô bệnh học cho thấy các vị trí hoại tử ở các sợi cơ vân và có hiện tượng viêm, phù, xuất huyết giữa các sợi cơ, xuất hiện thể ẩn trong tế bào chất.

Tôm bị nhiễm nặng, phần cơ ở bụng bị hoại tử nghiêm trọng và sự xâm nhập với số lượng lớn của các tế bào máu vào vùng bị viêm."

Theo đó, để tiến hành phương pháp mô học nhằm chẩn đoán bệnh ở tôm thì tiến hành theo các bước được quy định ở trên.

Khi tôm bị bệnh IMNV, kết quả mô bệnh học cho thấy các vị trí hoại tử ở các sợi cơ vân và có hiện tượng viêm, phù, xuất huyết giữa các sợi cơ, xuất hiện thể ẩn trong tế bào chất.

Tôm bị nhiễm nặng, phần cơ ở bụng bị hoại tử nghiêm trọng và sự xâm nhập với số lượng lớn của các tế bào máu vào vùng bị viêm.