Cách tiến hành phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?

Nội dung chính

• Triệu chứng lâm sàng khi cá chép mắc bệnh xuất huyết mùa xuân gồm những triệu chứng nào?
• Thực hiện lấy mẫu chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao?
• Cách tiến hành phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?

Triệu chứng lâm sàng khi cá chép mắc bệnh xuất huyết mùa xuân gồm những triệu chứng nào?

Theo Mục 5 TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về chẩn đoán lâm sàng như sau:

"5 Chẩn đoán lâm sàng

...

5.2 Triệu chứng lâm sàng

Dấu hiệu bệnh lý đầu tiên là cá bơi ở tầng mặt tụ thành đám ở rìa ao, mất thăng bằng, lờ đờ sau đó chết chìm xuống đáy.

Da có màu tối, mang nhợt nhạt, các tơ mang dính kết lại.

Xuất huyết điểm trên da, mang và ở mắt.

Có thể xuất huyết tràn lan trên da, gốc vây và hậu môn.

Máu loãng chảy ra từ hậu môn.

Cá chết đột ngột không thể hiện dấu hiệu bệnh lý, tỉ lệ chết cao.

..."

Theo đó, cá chép khi mắc bệnh xuất huyết mùa xuân sẽ có một số triệu chứng lâm sàng như:

- Cá bơi ở tầng mặt tụ thành đám ở rìa ao, mất thăng bằng, lờ đờ sau đó chết chìm xuống đáy.

- Da có màu tối, mang nhợt nhạt, các tơ mang dính kết lại.

- Xuất huyết điểm trên da, mang và ở mắt.

- Có thể xuất huyết tràn lan trên da, gốc vây và hậu môn.

- Máu loãng chảy ra từ hậu môn.

- Cá chết đột ngột không thể hiện dấu hiệu bệnh lý, tỉ lệ chết cao.

Cách tiến hành phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?

Thực hiện lấy mẫu chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao?

Theo tiểu mục 6.1 Mục 6 TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về lấy mẫu chẩn đoán như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Cá ≤ 4 cm: Lấy cả con từ 5 đến 10 con;

- Cá từ 4 đến 6 cm: Lấy não và toàn bộ phủ tạng từ 5 con đến 10 con;

- Cá lớn: Lấy gan, thận, lách và não từ 5 con.

Mẫu bệnh phẩm để phân lập vi rút trên môi trường tế bào phải được lấy vô trùng, các bộ phận phải để riêng biệt trong từng túi hay lọ vô trùng, bảo ở nhiệt độ 2 đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 24 h sau khi lấy mẫu. Nên sử dụng môi trường vận chuyển mẫu vi rút hay môi trường nuôi cấy tế bào có bổ sung kháng sinh để bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển.

Mẫu bệnh phẩm để làm phản ứng RT- nested PCR và real time RT PCR có thể sử dụng cố định trong cồn 90% theo tỉ lệ mẫu : cồn (1:10) hoặc mẫu tươi, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và chuyển đến phòng thí nghiệm trong 48 h sau khi lấy mẫu. Mẫu tươi chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong cồn etanol từ 96 % đến 100 % theo tỷ lệ mẫu : cồn (1:10) (3.1.1)."

Số lượng mẫu thử cần lấy phụ thuộc vào kích thước của cá:

- Cá ≤ 4 cm: Lấy cả con từ 5 đến 10 con;

- Cá từ 4 đến 6 cm: Lấy não và toàn bộ phủ tạng từ 5 con đến 10 con;

- Cá lớn: Lấy gan, thận, lách và não từ 5 con.

Bên cạnh đó phải đảm bảo mẫu bệnh phẩm để phân lập vi rút trên môi trường tế bào phải được lấy vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 2 đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 24 h sau khi lấy mẫu.

Cách tiến hành phương pháp RT nested PCR để chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?

Theo tiểu mục 6.2 Mục 6 TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về cách tiến hành phương pháp RT- nested PCR như sau:

"6.2 Phương pháp RT- nested PCR

...

6.2.3 Cách tiến hành

6.2.3.1 Tách chiết RNA

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.9) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ Dụ: Sử dụng kít chiết tách InviMAG®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96 Cat hoặc Taco RNA/DNAkit hoặc Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA (Phụ lục B).

6.2.3.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT- nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/SVC R2 ở bước 1 và cặp mồi SVC F1/ SVC R4 ở bước 2 để phát hiện vi rút SVC, (xem phụ lục E, Bảng E.1).

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 pmol/µL làm gốc.

Mồi (3.2.1) được sử dụng ở nồng độ 20 µmol/pL: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (20 µl mồi gốc và 80 µl nước).

6.2.3.3 Tiến hành phản ứng RT-nPCR

Bước 1: Thực hiện phản ứng RT- PCR sử dụng cặp mồi SVC F1 /SVC R2, (xem phụ lục E).

Bước 2: Thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/ SVC R4, (xem phụ lục E).

6.2.2.3 Chạy điện di

6.2.2.3.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose (3.2.2) bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) trong bình thủy tinh, lắc đều rồi đun sôi.

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.4) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khuôn (4.2.6) đã được cài lược, không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm. Khi bản thạch đông, gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.2.7) đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.3) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain[1]) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.2.2.3.3 Điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.5) vào 8 µl sản phẩm RT - nested PCR (bước 2) trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) vào một giếng trên bản gel.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.7), ở hiệu điện thể 100 V trong thời gian 20 đến 30 min.

6.2.2.3.4 Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.2.8).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Đối chứng âm có kết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại);

- Đối chứng dương có kết quả dương tính được thể hiện bằng vệt sáng rõ có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp.

Với điều kiện phản ứng trên

Mẫu xét nghiệm âm tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

Mẫu xét nghiệm dương tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp;

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp mẫu dương tính yếu, có thể chỉ phát hiện được sản phẩm của bước hai 606 bp.

Như vậy, cách tiến hành cần thực hiện theo Tiêu chuẩn nêu trên. Việc chẩn đoán cần đảm bảo về các trang thiết bị, dụng cụ cần thiết, nên gửi mẫu thử đến phòng thí nghiệm để chẩn đoán; không nên tự thực hiện nếu không có trình độ chuyên môn cũng như các thiết bị hỗ trợ cho việc chẩn đoán.