Cần phải lấy bao nhiêu mẫu để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp PCR? Phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm hoạt động dựa trên nguyên tắc nào?

Nội dung chính

• Triệu chứng lâm sàng khi tôm nhiễm bệnh hoại tử gan tụy gồm những triệu chứng nào?
• Phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm hoạt động dựa trên nguyên tắc nào?
• Cần phải lấy bao nhiêu mẫu để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp PCR?
• Quá trình tách chiết DNA để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm trong phương pháp PCR được thực hiện như thế nào?

Triệu chứng lâm sàng khi tôm nhiễm bệnh hoại tử gan tụy gồm những triệu chứng nào?

Tại tiểu mục 3.1 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về triệu chứng lâm sàng ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

3.1. Chẩn đoán lâm sàng

...

3.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Tôm nằm một chỗ, giảm sinh trưởng, không ăn, đường tiêu hóa trống rỗng, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, tỷ lệ giữa trọng lượng và chiều dài nhỏ.

Lớp vỏ bị mềm, tôm bị mềm, mang bị đen hoặc sẫm màu, bề mặt cơ thể bám đầy các sinh vật cơ hội. Tôm bị hôn mê, lờ đờ, gan tụy hoại tử và có màu trắng nhợt khác biệt với màu nâu vàng bình thường, có các vệt sọc nâu đen trên mô gan tụy, gan tụy mềm, dễ nát vụn hay hóa lỏng, trung tâm gan chứa nước, xuất hiện những đốm trắng nhợt nhạt.

Theo Tiêu chuẩn trên có thể thấy các triệu chứng thông qua hoạt động của tôm như tôm nằm một chỗ, giảm sinh trưởng, không ăn, đường tiêu hóa trống rỗng, hệ số chuyển đổi thức ăn cao.

Các triệu chứng trên cơ thể có thể nhận biết tôm mắc bệnh như tỷ lệ giữa trọng lượng và chiều dài nhỏ; vỏ bị mềm, tôm bị mềm, mang bị đen hoặc sẫm màu, bề mặt cơ thể bám đầy các sinh vật cơ hội, có dấu hiệu hôm mê, lờ đờ.

Sử dụng các thiết bị hỗ trợ quan sát sẽ thấy gan tụy hoại tử và có màu trắng nhợt khác biệt với màu nâu vàng bình thường, có các vệt sọc nâu đen trên mô gan tụy, gan tụy mềm, dễ nát vụn hay hóa lỏng, trung tâm gan chứa nước, xuất hiện những đốm trắng nhợt nhạt.

Triệu chứng lâm sàng khi tôm nhiễm bệnh hoại tử gan tụy gồm những triệu chứng nào? (Hình từ Internet)

Phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm hoạt động dựa trên nguyên tắc nào?

Theo tiết 3.2.1.1 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về nguyên tắc phương pháp PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.2.1. Phương pháp PCR

3.2.1.1. Nguyên tắc

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (cCTP), dùng để khuếch đại đoạn DNA đích thông qua các chu trình nhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại DNA đích gồm 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch DNA mới."

Như vậy, nguyên tắc hoạt động của phương pháp PCR là dựa trên hoạt động của DNA polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (cCTP), dùng để khuếch đại đoạn DNA đích thông qua các chu trình nhiệt.

Cần phải lấy bao nhiêu mẫu để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp PCR?

Theo tiết 3.2.1.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về số lượng mẫu cần lấy để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.4. Lấy mẫu

Tôm bố mẹ: Lấy mẫu phân tôm bố mẹ.

Tôm giống (> postlarvae 8, hay hậu ấu trùng lớn hơn 8 ngày tuổi) đến tôm trưởng thành: lấy một phần khối gan tụy của từ 5 con đến 10 con.

Tôm nhỏ hơn tôm giống (nhỏ hơn postlarvae 8): lấy phần đầu của từ 10 con đến 15 con.

Ấu trùng biến thái: lấy cả con, khoảng 50 con.

Lượng mẫu lấy để tách chiết DNA khoảng 20 mg, có thể dùng tôm còn sống hoặc mẫu tôm, mẫu phân cố định trong etanol 95 % để tách chiết DNA."

Theo đó, tùy vào loại tôm mà người nuôi cần chẩn đoán mà số lượng cần sẽ khác nhau:

- Tôm bố mẹ: Lấy mẫu phân tôm bố mẹ.

- Tôm giống, tôm trưởng thành: lấy một phần khối gan tụy của từ 5 con đến 10 con.

- Tôm nhỏ hơn tôm giống: lấy phần đầu của từ 10 con đến 15 con.

Quá trình tách chiết DNA để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm trong phương pháp PCR được thực hiện như thế nào?

Theo tiết 3.2.1.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về việc thực hiện tác chiết DNA như sau

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.1. Tách chiết DNA

CHÚ THÍCH: Hiện nay có nhiều thuốc thử và bộ kít thương mại tiện lợi cho việc tách chiết DNA (QiaGen, Promega, IQ,…). Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ví dụ về quy trình tách chiết DNA bằng dung dịch đệm DTAB-CTAB (kít IQ 2000):

Cho mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml, nếu mẫu cố định trong etanol 95 % cần làm khô etanol bằng cách đổ etanol và dốc ngược trên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên.

Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 µl đến 200 µl dung dịch tách chiết DTAB, nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng 400 µl đến 500 µl dung dịch tách chiết DTAB và nghiền tiếp đến khi nhuyễn.

Ủ mẫu ở 75 °C trong 5 min, sau đó làm lạnh xuống nhiệt độ phòng.

Trộn đều bằng máy trộn vortex và làm lắng hỗn hợp trên, sau đó cho 700 µl cloroform, trộn đều trong 20 s và ly tâm ở 12 000 g trong 5 min.

Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang ống Eppendorft 1,5 ml mới, thêm 100 µl dung dịch CTAB và 900 µl nước, trộn đều, sau đó ủ ở 75 °C trong 5 min.

Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm ở 12 000 g trong 10 min. Gạn bỏ dịch nổi, hòa tan phần còn lại bằng 150 µl dung dịch hòa tan, ủ ở 75 °C trong 5 min, sau đó làm lạnh xuống nhiệt độ phòng.

Ly tâm ở 12 000 g trong 5 min. Chuyển dung dịch sạch sang ống Eppendorft 1,5 ml cùng 300 µl etanol 95 %.

Trộn đều, ly tâm ở 12 000 g trong 5 min, sau đó rửa viên cùng 200 µl etanol 75 %, làm lắng xuống, làm khô viên và hòa tan viên bằng nước hoặc đệm TE.

..."

Theo đó quá trình tách chiết DNA được thực hiện theo Tiêu chuẩn vừa nêu trên.

Hiện nay có nhiều thuốc thử và bộ kít thương mại tiện lợi cho việc tách chiết DNA (QiaGen, Promega, IQ,…). Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.