Cặp mồi trong phương pháp Realtime PCR để phát hiện vi bào tử trùng gây nên bệnh vi bào tử ở tôm có khác với cặp mồi dùng trong phương pháp PCR không?

Nội dung chính

• Chuẩn bị mẫu thử cho phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm ra sao?
• Cặp mồi trong phương pháp Realtime PCR để phát hiện vi bào tử trùng gây nên bệnh vi bào tử ở tôm có khác với cặp mồi dùng trong phương pháp PCR không?
• Mẫu đối chứng sau khi thực hiện phương pháp Realtime PCR cho kết quả như thế nào thì được xác định là dương tính với bệnh vi bào tử?

Chuẩn bị mẫu thử cho phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm ra sao?

Theo tiết 6.2.3 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về việc chuẩn bị mẫu thử đối với phương pháp Realtime PCR như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phương pháp Realtime PCR

...

6.2.3 Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3)

Đối chiếu tiết 6.1.3 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

..

6.1.3 Chuẩn bị mẫu

Đối với tôm ấu trùng, hậu ấu trùng: sử dụng nguyên con.

Đối với tôm bố mẹ, tôm thương phẩm: cắt lấy khối gan tụy.

Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg.

Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm phosphat PBS (3.1.2), để tạo thành huyễn dịch 10 %. Mẫu được chia thành hai phần: một phần cho thực hiện xét nghiệm và một phần lưu trữ ở tủ âm (-80 °C)"

Theo đó, mẫu thử dùng cho phương pháp Realtime PCR là:

- Đối với tôm ấu trùng, hậu ấu trùng: sử dụng nguyên con.

- Đối với tôm bố mẹ, tôm thương phẩm: cắt lấy khối gan tụy.

Cặp mồi trong phương pháp Realtime PCR để phát hiện vi bào tử trùng gây nên bệnh vi bào tử ở tôm có khác với cặp mồi dùng trong phương pháp PCR không? (Hình từ Internet)

Cặp mồi trong phương pháp Realtime PCR để phát hiện vi bào tử trùng gây nên bệnh vi bào tử ở tôm có khác với cặp mồi dùng trong phương pháp PCR không?

Theo tiết 6.2.5 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phương pháp Realtime PCR

...

6.2.5 Chuẩn bị mồi và mẫu đối chứng

Phương pháp Realtime PCR sử dụng cặp mồi EHP-F157, EHP-R157, đoạn dò Probe 157 (3.2.2) để phát hiện vi bào tử trùng do Enterocytozoon hepatopenaei. Trình tự cặp mồi và đoạn dò (xem Bảng D.4).

Mồi được chuẩn bị như sau:

Mồi và đoạn dò (Probe) ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi và đoạn dò (Probe) được sử dụng ở nồng độ 10 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (10 µl mồi gốc và 90 µl nước tinh khiết không có nuclease).

..."

Bên cạnh đó tại Mục C.1 Phục lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR như sau:

C.1 Trình tự cặp mồi

Theo đó, cặp mồi sử dụng trong phương pháp Realtime PCR là EHP-F157, EHP-R157, đoạn dò Probe 157; còn cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR là EHP-510F, EHP-510R.

Cặp mồi sử dụng trong phương pháp Realtim PCR được sử chuẩn bị như sau:

Mồi và đoạn dò (Probe) ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh spindown trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi và đoạn dò (Probe) được sử dụng ở nồng độ 10 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước tinh khiết không có nuclease).

Mẫu đối chứng sau khi thực hiện phương pháp Realtime PCR cho kết quả như thế nào thì được xác định là dương tính với bệnh vi bào tử?

Theo tiết 6.2.7 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về việc đọc kết quả mẫu chẩn đoán phương pháp Realtime PCR như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phương pháp Realtime PCR

...

6.2.7 Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct);

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct dao động ± 2.

Với điều kiện phản ứng như trên:

- Mẫu dương tính khi có giá trị Ct < 35

- Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ

CHÚ Ý:

- Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

- Phản ứng realtime - PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng."

Như vậy mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct dao động ± 2.