Có bao nhiêu phương pháp có thể dùng để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm ngoài phương pháp RT PCR?

Nội dung chính

• Tỉ lệ chết của tôm có thể lên đến bao nhiêu phần trăm khi mắc bệnh hoại tử cơ?
• Có bao nhiêu phương pháp có thể dùng để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm ngoài phương pháp RT PCR?
• Khi tiến hành phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp RT PCR thì cần chuẩn bị những gì để phù hợp với tiêu chuẩn?

Tỉ lệ chết của tôm có thể lên đến bao nhiêu phần trăm khi mắc bệnh hoại tử cơ?

Theo tiểu mục 3.1 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về triệu chứng lâm sàng khi tôm mắc bệnh hoại tử cơ như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

3.1. Chẩn đoán lâm sàng

3.1.1. Dịch tễ học

Vi rút gây bệnh IMNV cảm nhiễm chủ yếu trên các tôm thuộc họ Tôm he (Penaeidae): Penaeus vannamei, Ρ.stylirostris, Ρ.monodon… gây tỉ lệ chết cao. Tỷ lệ tôm nhiễm bệnh trong ao, bể có thể lên đến 100 %, tỷ lệ gây chết khoảng 40 % đến 70 %.

Bệnh có thể lan truyền từ bố mẹ truyền vi rút gây bệnh cho con cái thông qua quá trình sinh sản. Hoặc bệnh lan truyền thông qua những sinh vật mang mầm bệnh vào vùng nuôi như chim ăn những con tôm bệnh hoặc tôm chết thải phân ra ngoài môi trường nuôi, thông qua kí chủ trung gian mang mầm bệnh vào ao bể nuôi, qua dùng chung dụng cụ, nguồn nước nhiễm bệnh.

Bệnh xuất hiện quanh năm, đặc biệt là mùa xuân và đầu hè khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ trong ngày biến thiên quá lớn, thay đổi độ mặn gây sốc cho tôm.

3.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn cấp tính của bệnh IMNV: cơ vân tôm vùng bụng kéo dọc đến phần đuôi bị hoại tử, có màu trắng đục. Tôm bơi lờ đờ, dạt bờ rồi chết. Tôm chết nhiều liên tiếp trong vài ngày, tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 40 % đến 70 % trong ao nhiễm.

CHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp, tôm bị stress do yếu tố môi trường hoặc tôm bị bệnh trắng đuôi cũng thể hiện dấu hiệu bệnh lý tương tự."

Như vậy, khi tôm mắc bệnh hoại tử cơ thì tỷ lệ lây nhiễm bệnh trong ao, bể có thể lên đến 100% và tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 40% - 70 % trong ao nhiễm.

Có bao nhiêu phương pháp có thể dùng để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm ngoài phương pháp RT PCR? (Hình từ Internet)

Có bao nhiêu phương pháp có thể dùng để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm ngoài phương pháp RT PCR?

Theo Mục 4 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về báo cáo kết quả chẩn đoán như sau:

"4. Báo cáo kết quả chẩn đoán

Tôm được xác định nhiễm bệnh IMNV khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng của bệnh và kết quả dương tính trong các phương pháp sau:

- Phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút dương tính;

- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút IMNV;

- Kết quả lai tại chỗ dương tính với IMNV."

Theo quy định trên, thì sẽ có 02 phương pháp để có thể chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm ngoài phương pháp RT PCR, gồm phương pháp mô học và phương pháp lai tại chỗ.

Khi tiến hành phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp RT PCR thì cần chuẩn bị những gì để phù hợp với tiêu chuẩn?

Theo tiết 3.2.1.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về phương pháp RT PCR như sau:

"3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.2.1. Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã ngược)

...

3.2.1.2. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.

- Trizol;

- Cloroform;

- Isopropanol;

- Etanol 75 % và 95 %;

- Dung dịch TBE 1X

Chuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X): hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, thêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X.

- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh đến pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

- Dung dịch DEPC

Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ - 20 oC

- Dung dịch TE (Tris - EDTA)

Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6.

- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR.

- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X).

- Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp.

- Etidi bromua (EtBr).

CẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp xúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay và mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.

- Gel agarose.

3.2.1.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Tủ lạnh;

- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ - 20 oC;

- Máy li tâm, có thể hoạt động với gia tốc 13000 g;

- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 oC;

- Máy lắc trộn vortex;

- Cân phân tích có thể cân chính xác đến 0,1 mg;

- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 l đến 10 l, từ 2 l đến 20 l, từ 10 l đến 100 l, từ 100 l đến 1000 l;

- Giá Eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;

- Máy luân nhiệt (máy PCR);

- Bếp điện hoặc lò vi sóng;

- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;

- Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml;

- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;

- Buồng đổ gel;

- Bàn đọc gel (UV);

- Giấy parafin."

Theo đó, cần chuẩn bị thuốc thử, vật liệu thử và các thiết bị dụng cụ theo Tiêu chuẩn nêu trên để thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp RT PCR.