Có thể tiến hành phương pháp PCR mà không cần thực hiện phương pháp Realtime PCR khi chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu của tôm hay không?

Nội dung chính

• Thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp PCR để thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm gồm những loại nào?
• Có thể tiến hành phương pháp PCR mà không cần thực hiện phương pháp Realtime PCR khi chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu của tôm hay không?
• Kết quả của phản ứng Realtime PCR như thế nào thì được xác định là dương tính?

Thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp PCR để thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm gồm những loại nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-20:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm quy định về thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp PCR như sau:

Thuốc thử, vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAse và DNAse, trừ khi có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho lấy mẫu

3.1.1 Cồn (Ethanol), từ 70 % đến 100 % (C2H6O);

3.1.2 Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) (xem Phụ lục A);

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR

3.2.1 Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;

3.2.2 Kít nhân gen PCR, realtime PCR;

3.2.3 Nước tinh khiết, không có DNAse/RNAse.

3.2.4 Bột agarose, dung dịch TBE 10X;

3.2.5 Chất nhuộm gel (GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

3.2.6 Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);

3.2.7 Thang chuẩn ADN;

3.2.8 Đoạn mồi (primers): thực hiện phản ứng PCR;

3.2.9 Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe): thực hiện phản ứng realtime PCR;

3.2.10 Mẫu đối chứng: Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa ADN của vi rút IHHN được chiết tách từ mẫu dương chuẩn. Mẫu đối chứng âm là mẫu nước không có DNAse/ RNAse dùng để pha loãng các chất phản ứng.

Theo tiêu chuẩn trên thì thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm gồm:

- Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;

- Kít nhân gen PCR, realtime PCR;

- Nước tinh khiết, không có DNAse/RNAse.

- Bột agarose, dung dịch TBE 10X;

- Chất nhuộm gel (GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

- Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);

- Thang chuẩn ADN;

- Đoạn mồi (primers): thực hiện phản ứng PCR;

- Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe): thực hiện phản ứng realtime PCR;

- Mẫu đối chứng

Tiến hành phương pháp PCR chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu của tôm (Hình từ Internet)

Có thể tiến hành phương pháp PCR mà không cần thực hiện phương pháp Realtime PCR khi chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu của tôm hay không?

Theo tiết 6.2.1.1 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-20:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm quy định về nguyên tắc thực hiện phương pháp Realtime PCR như sau:

6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện vi rút IHHN

6.2.1 Phương pháp realtime PCR

6.2.2.1 Nguyên tắc

Phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút IHHN dựa trên cơ sở xác định đoạn ADN đích của vi rút được khuếch đại. Đây là phản ứng sàng lọc phát hiện vi rút IHHN. Nếu kết quả xét nghiệm âm tính thì kết luận mẫu âm tính với vi rút IHHN, nếu kết quả dương tính thì thực hiện tiếp phản ứng PCR để phân biệt typ của vi rút IHHN.

LƯU Ý: Nên tiến hành xét nghiệm sàng lọc bằng phản ứng realtime PCR để phát hiện vi rút IHHN trước.

...

Bên cạnh đó, theo tiết 6.2.2.1 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-20:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm quy định về nguyên tắc thực hiện phản ứng PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện vi rút IHHN

...

6.2.2 Phương pháp PCR

6.2.2.1 Nguyên tắc

Phương pháp PCR được thực hiện sau khi có kết quả của phản ứng realtime PCR là dương tính hoặc được thực hiện trực tiếp sau khi tách chiết ADN. Phản ứng này để phân biệt các dạng typ của vi rút IHHN bằng cách sử dụng cặp mồi 309F/309R (phát hiện vi rút IHHN typ gây bệnh: typ 1 và 2 và cặp mồl MG831F/MG831R (phát hiện vi rút IHHN typ không gây bệnh: typ 3A/ 3B và một phần đoạn gen của P. monodon (đoạn chèn của vi rút này vào gen của vật chủ P. monodon)).

...

Theo đó, phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút IHHN dựa trên cơ sở xác định đoạn ADN đích của vi rút được khuếch đại. Nếu kết quả dương tính thì thực hiện tiếp phản ứng PCR để phân biệt typ của vi rút IHHN.

Đối với phản ứng PCR thì đây là phản ứng được thực hiện sau khi có kết quả của phản ứng realtime PCR là dương tính hoặc được thực hiện trực tiếp sau khi tách chiết ADN.

Như vậy, cần phải thực hiện phương pháp Realtime PCR trước khi thực hiện phản ứng PCR để xác định vi rút gây nên bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm

Kết quả của phản ứng Realtime PCR như thế nào thì được xác định là dương tính?

Theo tiết 6.2.1.4 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-20:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm quy định về kết quả phản ứng Realtime PCR như sau:

6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện vi rút IHHN

6.2.1 Phương pháp realtime PCR

6.2.1.4 Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct < 35 được coi là dương tính. Mẫu không có giá trị Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 ≤ Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.

LƯU Ý: Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

Như vậy, kết quả phán ứng Realtime PCR được xác định là dương tính khi mẫu đối chứng có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct) (mẫu có giá trị Ct < 35 được coi là dương tính).

Trường hợp mẫu đối chứng âm tính thì sẽ không có Ct (mẫu có giá trị 35 ≤ Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ).