Để chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt bằng phương pháp tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt thì cần chuẩn bị tế bào tiêm truyền như thế nào?

Nội dung chính

• Mẫu bệnh phẩm dùng trong việc chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt cần được xử lý như thế nào?
• Để chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt bằng phương pháp tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt thì cần chuẩn bị tế bào tiêm truyền như thế nào?
• Phương pháp tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt để chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt thực hiện ra sao?

Mẫu bệnh phẩm dùng trong việc chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt cần được xử lý như thế nào?

Theo tiết 5.2.2.1 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-9:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán – phần 9: bệnh viêm gan vịt typ I quy định về việc xử lý mẫu bệnh phẩm dùng trong việc chẩn đoán bệnh viêm gan typ I như sau:

Cách tiến hành

...

5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

5.2.2 Phát hiện và giám định vi rút

5.2.2.1 Xử lý bệnh phẩm

Bệnh phẩm gan, lách nghiền trong cối chày sứ với dung dịch PBS (A.2) thành huyễn dịch 10 % sau đó xử lý với kháng sinh penicillin (200 UI/ml) và streptomycin (200 µg/ml), hoặc có thể lọc vô trùng qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm. Ly tâm huyễn dịch bệnh phẩm 2000 r/min trong 15 min. Hút lấy dịch nước trong ở phía trên khoảng 3 ml đến 4 ml. Xử lý dịch thu được bằng cloroform 5 % trong 15 min ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra vô trùng của mẫu trên môi trường BHI hoặc môi trường thạch máu.

...

Mẫu bệnh phẩm là gà, lách của vịt con có dấu hiệu mắc bệnh viêm gan typ I đem đi thành huyễn dịch 10 % sau đó xử lý với kháng sinh penicillin (200 UI/ml) và streptomycin (200 µg/ml), hoặc có thể lọc vô trùng qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm. Ly tâm huyễn dịch bệnh phẩm 2000 r/min trong 15 min.nghiền trong cối chày sứ với dung dịch PBS.

Hút lấy dịch nước trong ở phía trên khoảng 3 ml đến 4 ml. Xử lý dịch thu được bằng cloroform 5 % trong 15 min ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra vô trùng của mẫu trên môi trường BHI hoặc môi trường thạch máu.

Để chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt bằng phương pháp tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt thì cần chuẩn bị tế bào tiêm truyền như thế nào? (Hình từ Internet)

Để chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt bằng phương pháp tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt thì cần chuẩn bị tế bào tiêm truyền như thế nào?

Theo Phụ lục B Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-9:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán – phần 9: bệnh viêm gan vịt typ I quy định về cách chuẩn bị tế bào gan phôi vịt cho phương pháp tiêm truyền chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt như sau:

Bước 1: Chuẩn bị

Phôi trứng vịt khỏe mạnh từ 14 ngày tuổi đến 16 ngày tuổi.

Dung dịch PBS pH 7,2 (A.2) chứa 1 % dung dịch kháng khuẩn (A.1).

Dung dịch trypsin 0,25 % [pha loãng 10 lần trypsin 2,5 % với PBS pH 7,2 (A.2)]. Môi trường MEM và huyết thanh thai bê FCS.

Đĩa petri, panh, kéo, cốc đong thủy tinh, chai tam giác vô trùng.

Bước 2: Tiến hành

Sát trùng trứng bằng cồn 70 %, mổ trứng lấy phôi vịt.

Rửa phôi 3 lần bằng dung dịch PBS pH 7,2 (A.2) có chứa 1 % kháng sinh trong đĩa petri. Bộc lộ gan phôi, thu hoạch lấy gan phôi sang một đĩa petri khác.

Rửa gan phôi 1 lần đến 2 lần trong dung dịch PBS pH 7,2 (A.2) có chứa 1 % kháng sinh. Cắt nhỏ gan phôi, đổ vào chai tam giác.

Cho dung dịch trypsin ấm 0,25 % vào để tách gan phôi và lắc nhẹ 250 r/min trong 15 min.

Thu hoạch tế bào đã tách trong phần nước trong ở trên cho vào môi trường MEM có 10 % FCS.

Tiếp tục cho dung dịch trypsin 0,25 % vào phần tổ chức còn lại để tách tiếp tế bào. Thực hiện như vậy 2 lần đến 3 lần.

Chuyển toàn bộ phần huyễn dịch tế bào thu được sang ống Falcon 50 ml vô trùng, ly tâm 1500 r/min trong 5 min.

Đổ bỏ phần nước trên, giữ lại phần tế bào gan phôi lắng ở đáy ống Falcon, rửa bằng môi trường MEM.

Đếm và pha loãng tế bào với môi trường phát triển MEM có 10% FCS, lượng tế bào cần thiết tối thiểu là 4 x 105 tế bào/ml.

Chuẩn bị môi trường phát triển MEM có 10 % FCS, chia vào các chai nuôi cấy với lượng cần thiết (25 ml cho chai T75, 10 ml cho chai T25). Sau đó dùng pipet chuyển dung dịch môi trường có chứa tế bào ở trên vào các chai với lượng 5ml cho chai T75, 3 ml cho chai T25.

Đối với đĩa để nuôi cấy (đĩa 6 giếng, hoặc 24 giếng hoặc 96 giếng) thì tế bào được pha loãng luôn với môi trường phát triển MEM có 10 % FCS, rồi chia vào các giếng với tỷ lệ theo quy định để đảm bảo tối thiểu có 5 x 104 tế bào/ml (với đĩa 6 giếng là 3 ml/giếng, với đĩa 24 giếng là 1 ml/ giếng, với đĩa 96 giếng là 100 µl/giếng).

Sau đó nuôi ở tủ ấm 37 0C có 5 % CO2. Sau 1 ngày đến 2 ngày đổ bỏ môi trường cũ, rửa sạch thảm tế bào bằng dung dịch PBS (A.2), cho tiếp môi trường phát triển MEM mới vào nuôi tiếp. Khi tế bào mọc đạt 80 % đến 90 % thì có thể sử dụng.

Phương pháp tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt để chẩn đoán bệnh viêm gan typ I ở vịt thực hiện ra sao?

Theo tiết 5.2.2.2.3 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-9:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán – phần 9: bệnh viêm gan vịt typ I quy định về phương pháp tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt như sau:

Cách tiến hành

...

5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

5.2.2 Phát hiện và giám định vi rút

...

5.2.2.2.3 Tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt (DEL)

Chuẩn bị tế bào DEL nuôi cấy lên các chai nuôi tế bào T25 hoặc đĩa nuôi cấy 6 giếng hay 24 giếng (xem Phụ lục B). Sau từ 2 ngày đến 3 ngày, tế bào mọc thành thảm (khoảng 80 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm (5.2.2.1) với liều 50 µl/giếng đến 100 µl/giếng hoặc 500 µl/chai.

Kiểm tra tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi. Quan sát CPE với đặc điểm thảm tế bào bong tróc, các tế bào co tròn và tụ lại từng đám. CPE thường xuất hiện sau 4 ngày đến 7 ngày gây nhiễm.

Sau 7 ngày thu huyễn dịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu dịch nước trong cho giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần 2

...

Dùng tế bào phôi vịt đã chuẩn bị nuôi cấy lên các chai nuôi tế bào T25 hoặc đĩa nuôi cấy 6 giếng hay 24 giếng. Sau từ 2 ngày đến 3 ngày, tế bào mọc thành thảm (khoảng 80 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm với liều 50 µl/giếng đến 100 µl/giếng hoặc 500 µl/chai.

Kiểm tra tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi. Quan sát CPE (tế bào bệnh tích) với đặc điểm thảm tế bào bong tróc, các tế bào co tròn và tụ lại từng đám. CPE thường xuất hiện sau 4 ngày đến 7 ngày gây nhiễm.

Sau 7 ngày thu huyễn dịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu dịch nước trong cho giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần 2