Để chẩn đoán tôm có mắc bệnh hoại tử gan tụy không bằng phương pháp PCR thì phải tiến hành lấy mẫu chẩn đoán như như thế nào?

Nội dung chính

• Tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy thường sẽ có những triệu chứng lâm sàng như thế nào?
• Thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp PCR cần sử dụng thuốc thử và vật liệu thử nào?
• Để chẩn đoán tôm có mắc bệnh hoại tử gan tụy không bằng phương pháp PCR thì phải tiến hành lấy mẫu chẩn đoán như như thế nào?

Lấy mẫu chẩn đoán tôm có mắc bệnh hoại tử gan tụy không? (Hình từ Internet)

Tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy thường sẽ có những triệu chứng lâm sàng như thế nào?

Theo tiểu mục 3.1 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về triệu chứng lâm sàng ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

3.1. Chẩn đoán lâm sàng

3.1.1. Dịch tễ học

NHP lần đầu tiên được mô tả ở Texas năm 1985. Các trận dịch khác cũng được ghi nhận ở cả bờ biển Thái Bình Dương và Đại Tây Dương, bao gồm Brazil, Costarica, Ecuador, Mexico, Panama, Peru và Venezuela. Năm 1999 và 2000, bệnh hoại tử gan đã xảy ra trên tôm sú (Penaeus monodon) nuôi thâm canh tại các tỉnh miền Trung Việt Nam.

NHP gây bệnh trên tôm Penaeus vannamei và P. stylirostris nhưng gây chết hàng loạt ở tôm P. vannamei, cũng tìm thấy NHP ở tôm P. aztecus, P. californiensis và P. setiferus.

Bệnh thường xảy ra khi nhiệt độ môi trường tăng cao (từ 29 °C tới 32 °C) và hàm lượng muối trong nước cao (từ 20 ppt tới 40 ppt), tỷ lệ chết có thể từ 90 % tới 95 % trong 30 ngày.

Bệnh lan truyền trực tiếp qua đường tiêu hóa từ những con tôm mang trùng, không lan truyền dọc từ tôm bố mẹ sang tôm con.

3.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Tôm nằm một chỗ, giảm sinh trưởng, không ăn, đường tiêu hóa trống rỗng, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, tỷ lệ giữa trọng lượng và chiều dài nhỏ.

Lớp vỏ bị mềm, tôm bị mềm, mang bị đen hoặc sẫm màu, bề mặt cơ thể bám đầy các sinh vật cơ hội. Tôm bị hôn mê, lờ đờ, gan tụy hoại tử và có màu trắng nhợt khác biệt với màu nâu vàng bình thường, có các vệt sọc nâu đen trên mô gan tụy, gan tụy mềm, dễ nát vụn hay hóa lỏng, trung tâm gan chứa nước, xuất hiện những đốm trắng nhợt nhạt.

Theo tiêu chuẩn nêu trên thì tôm sẽ có triệu chứng lâm sàng như sẽ nằm một chổ, tỉ lệ sinh trưởng ở tôm giảm, không ăn, đường tiêu hóa rỗng, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, tỷ lệ giữa trọng lượng và chiều dài nhỏ.

Khi tới giai đoạn nặng hơn tôm sẽ có một số dấu hiệu thể hiện rõ ở bên ngoài như lớp vỏ bị mềm, tôm bị mềm, mang bị đen hoặc sẫm màu, bề mặt cơ thể bám đầy các sinh vật cơ hội.

Tôm sẽ có tình trạng bị hôn mê, lờ đờ, gan tụy bị hoại tử và có màu trắng nhợt khác biệt với màu nâu vàng bình thường, có các vệt sọc nâu đen trên mô gan tụy, gan tụy mềm, dễ nát vụn hay hóa lỏng, trung tâm gan chứa nước, xuất hiện những đốm trắng nhợt nhạt.

Thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp PCR cần sử dụng thuốc thử và vật liệu thử nào?

Theo tiết 3.2.1.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về thuốc thử và vật liệu thử trong phương pháp PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.2.1. Phương pháp PCR

3.2.1.2. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch đệm TE (Tris - EDTA)

Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng axit clohydric (HCl) để chỉnh pH 7,6.

- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic), 0,5 M

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

- Dung dịch TBE 1 X

Chuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X): Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, thêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nước đến 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch 1X.

- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X).

- Cồn 75 %.

- Cloroform.

- Bộ kít tách chiết DNA, ví dụ: NHP IQ 2000.

- Thang chuẩn DNA (DNA marker), gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp.

- Etidi bromua (EtBr).

CẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp xúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay và mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.

- Agarose"

Như vậy, cần chuẩn bị các loại thuốc thử và vật liệu thử nêu trên để tiến hành chẩn đoán tôm có mắc bệnh hoại tử gan tụy hay không.

Lưu ý, trong các loại thuốc thử thì Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp xúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay và mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.

Để chẩn đoán tôm có mắc bệnh hoại tử gan tụy không bằng phương pháp PCR thì phải tiến hành lấy mẫu chẩn đoán như như thế nào?

Theo tiết 3.2.1.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về lấy mẫu ở tôm để tiến hành chẩn đoán như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.2.1. Phương pháp PCR

...

3.2.1.4. Lấy mẫu

Tôm bố mẹ: Lấy mẫu phân tôm bố mẹ.

Tôm giống (> postlarvae 8, hay hậu ấu trùng lớn hơn 8 ngày tuổi) đến tôm trưởng thành: lấy một phần khối gan tụy của từ 5 con đến 10 con.

Tôm nhỏ hơn tôm giống (nhỏ hơn postlarvae 8): lấy phần đầu của từ 10 con đến 15 con.

Ấu trùng biến thái: lấy cả con, khoảng 50 con.

Lượng mẫu lấy để tách chiết DNA khoảng 20 mg, có thể dùng tôm còn sống hoặc mẫu tôm, mẫu phân cố định trong etanol 95 % để tách chiết DNA.

The đó, có thể tiến hành chẩn đoán bằng

- Mẫu phân tôm bố mẹ.

- Tôm giống đến tôm trưởng thành: lấy một phần khối gan tụy của từ 5 con đến 10 con.

- Tôm nhỏ hơn tôm giống lấy phần đầu của từ 10 con đến 15 con.

- Ấu trùng biến thái: lấy cả con, khoảng 50 con.