Để tạo tế bào Pam dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên tế bào để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn cần chuẩn bị những gì?

Nội dung chính

• Để tạo tế bào PAM dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên tế bào để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn cần chuẩn bị những gì?
• Việc tạo ra tế bào Pam để thực hiện phương pháp phân lập vi rút trên tế bào thực hiện như thế nào?
• Dùng tế bào PAM thực hiện phương pháp phân lập vi rút trên tế bào để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn như thế nào?

Để tạo tế bào PAM dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên tế bào để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn cần chuẩn bị những gì?

Theo điểm C.1 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) thì những nguyên vặt liệu, dụng cụ dùng cho việc tạo tế bào PAM gồm:

- Lợn con khỏe mạnh dưới 8 tuần tuổi, thuộc đàn miễn nhiễm với bệnh PRRS hoặc là lợn SPF.

- Dung dịch PBS pH 7,2 chứa 1 % dung dịch kháng khuẩn.

- Dung dịch trypsin 0,25 % (pha loãng 2 lần Trypsin 0,5 % với PBS pH 7,2).

- Môi trường tế bào MEM và FCS.

- Dao, panh, kéo, chai thủy tinh vô trùng.

Việc tạo ra tế bào Pam để thực hiện phương pháp phân lập vi rút trên tế bào thực hiện như thế nào?

Theo điểm C.1 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) việc tạo ra tế bào PAM được thực hiện theo các bước sau:

- Mổ lợn, tiến hành lấy phổi lợn một cách vô trùng (chú ý không được làm rách phổi). Sau đó tiến hành các bước để thu hoạch tế bào PAM trong buồng cấy an toàn sinh học cấp 2 .

- Rửa phổi lợn bằng cách đổ dung dịch PBS pH 7,2 có chứa 1 % dung dịch kháng khuẩn với lượng 200 ml/lần vào ống khí quản, dùng tay bóp nhẹ phổi để rửa. Sau đó dốc ngược phổi vào chai thủy tinh vô trùng để thu lại toàn bộ phần nước rửa phổi này.

- Tiến hành rửa phổi lợn 3 lần.

- Các lần rửa phổi phải được tiến hành cẩn thận và vô trùng.

- Sau 3 lần rửa phổi vô trùng sẽ thu hoạch được nước rửa phổi có chứa tế bào đại thực bào PAM trong chai thủy tinh vô trùng.

- Chuyển toàn bộ phần dung dịch rửa phổi có chứa tế bào thu được sang ống ly tâm 50 ml vô trùng, ly tâm ở gia tốc 1500g trong 10 min.

-Đổ bỏ phần nước trên, giữ lại phần tế bào sơ cấp PAM lắng ở đáy ống ly tâm, rửa và ly tâm 1 lần nữa với dung dịch PBS.

- Pha loãng tế bào với môi trường phát triển MEM có 10 % FCS (xem phụ lục A) và đếm tế bào để được lượng tế bào cần thiết tối thiểu là 4 x 107 tế bào/1 ml.

- Chuẩn bị môi trường phát triển MEM có 10 % FCS, chia vào các chai nuôi tế bào với lượng cần thiết (20 ml trên chai 75 cm2, 10 ml trên chai 25 cm2). Sau đó dùng pipet chuyển dung dịch môi trường có chứa tế bào ở trên vào các chai với lượng 5ml trên chai 75 cm2, 3 ml trên chai 25 cm2.

- Đối với đĩa nuôi tế bào (đĩa 24 giếng hoặc 96 giếng) thi tế bào được pha loãng luôn với môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS, rồi chia vào các giếng với tỷ lệ theo quy định để đảm bảo tối thiểu có 5 x 104 tế bào/ml. (Với đĩa 24 giếng là 1 ml/ giếng, với đĩa 96 giếng là 100 μl/giếng).

- Sau đó nuối ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO2. Sau 1 ngày đến 2 ngày đổ bỏ môi trường cũ, rửa sạch thảm tế bào bằng dung dịch PBS, cho tiếp môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS mới vào nuôi tiếp. Khi tế bào mọc đạt từ 80 % đến 90 % thì có thể sử dụng.

Để tạo tế bào Pam dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên tế bào để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn cần chuẩn bị những gì? (Hình từ Internet)

Dùng tế bào PAM thực hiện phương pháp phân lập vi rút trên tế bào để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn như thế nào?

Theo tiết 5.2.2.3 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) quy định về phương pháp phân lập vi rút trên tế bào như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.2.3. Phương pháp phân lập vi rút trên tế bào

- Chuẩn bị tế bào MARC-145 hoặc tế bào PAM (xem phụ lục C) nuôi cấy lên các chai nhựa nuôi tế bào 25 cm2 (xem 4.18) hoặc đĩa nhựa nuôi tế bào 24 giếng (xem 4.19) với môi trường phát triển tế bào (xem 3.1) MEM có 5% FCS (xem Phụ lục A). Sau 2 ngày đến 3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 80 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm (xem 5.2.2.1) với liều 50 μl/giếng đến 100 μl/giếng hoặc 500 μl/chai.

- Kiểm tra tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi soi ngược (xem 4.9). Nếu có vi rút PRRS, vi rút sẽ gây nên những biến đổi bệnh tích tế bào (CPE) với đặc điểm các tế bào co tròn, thảm tế bào bong tróc khỏi bề mặt dụng cụ nuôi cấy. CPE thường xuất hiện sau 4 ngày đến 7 ngày gây nhiễm.

- Sau 7 ngày thu lấy hết huyễn dịch tế bào vào ống ly tâm 50 ml (xem 4.14), cất ở tủ lạnh âm sâu (xem 4.1), sau đó lấy ra rã đông, ly tâm bằng máy ly tâm (xem 4.6) ở gia tốc 3000 g trong 10 min. Thu dịch nước trong cho giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần thứ hai.

...

Dùng tế bào PAM đã chuẩn bị để nuôi cấy lên các chai nhựa nuôi tế bào 25 cm2 hoặc đĩa nhựa nuôi tế bào 24 giếng với môi trường phát triển tế bào MEM có 5% FCS. Sau 2 ngày đến 3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 80 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm với liều 50 μl/giếng đến 100 μl/giếng hoặc 500 μl/chai.

Kiểm tra tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi soi ngược. Nếu có vi rút PRRS, vi rút sẽ gây nên những biến đổi bệnh tích tế bào (CPE) với đặc điểm các tế bào co tròn, thảm tế bào bong tróc khỏi bề mặt dụng cụ nuôi cấy. CPE thường xuất hiện sau 4 ngày đến 7 ngày gây nhiễm.

Sau 7 ngày thu lấy hết huyễn dịch tế bào vào ống ly tâm 50 ml cất ở tủ lạnh âm sâu, sau đó lấy ra rã đông, ly tâm bằng máy ly tâm (xem 4.6) ở gia tốc 3000 g trong 10 min. Thu dịch nước trong cho giám định vi rút gây nên hội hứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.