Để thực hiện phương pháp nhuộm Gram để phát hiện vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà cần những loại thuốc nhuộm nào cho quá trình thực hiện?

Nội dung chính

• Để nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà trên thạch máu thì cần thực hiện ra sao?
• Trước khi thực hiện phương pháp nhuộm Gram để phát hiện vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà cần cố định tiêu bản như thế nào?
• Để thực hiện phương pháp nhuộm Gram để phát hiện vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà cần những loại thuốc nhuộm nào cho quá trình thực hiện?
• Phương pháp nhuộm Gram được thực hiện theo trình tự như thế nào để có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà?

Để nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà trên thạch máu thì cần thực hiện ra sao?

Căn cứ tiết 5.2.2 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) quy định về nuôi cấy vi khuẩn như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.2. Nuôi cấy, phản lập vi khuẩn

Bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường thạch máu (xem 3.1) có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus hoặc thạch sô-cô-la (xem 3.2). Nuôi vi khuẩn trong tủ ấm (xem 4.1) trong 24 h. Nếu trong mẫu bệnh phẩm có vi khuẩn, các khuẩn lạc sẽ được hình thành với hình thái như sau:

a) Trên môi trường thạch máu (xem 3.1) có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus có các khuẩn lạc tròn, trong suốt, kích thước nhỏ (khoảng 0,3 mm), không gây dung huyết, mọc xung quanh đường cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus.

b) Trên môi trường thạch sô-cô-la (xem 3.2) có các khuẩn lạc nhỏ (khoảng 0,3 mm), trong suốt.

Chọn khuẩn lạc có hình thái đặc trưng cấy vào môi trường thạch sô-cô-la (xem 3.2) nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) trong thời gian 24 h để tiến hành quan sát hình thái và kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn hoặc xác định vi khuẩn bằng PCR.

...

Bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường thạch máu có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus được nuôi trong tủ ấm trong 24 h. Nếu trong mẫu bệnh phẩm có vi khuẩn thì trên môi trường thạch máu sẽ có các khuẩn lạc tròn, trong suốt, kích thước nhỏ (khoảng 0,3 mm), không gây dung huyết, mọc xung quanh đường cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus.

Bệnh phù đầu gà (hình từ Internet)

Trước khi thực hiện phương pháp nhuộm Gram để phát hiện vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà cần cố định tiêu bản như thế nào?

Theo tiết 5.2.3.1 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) quy định về quan sát hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.3.1. Quan sát hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy

Làm tiêu bản và cố định tiêu bản: Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ thu được trong mục 5.2.2 hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính (xem 4.4). Cố định tiêu bản bằng cách để khô hoặc làm khô tiêu bản trên ngọn lửa của đèn cồn (xem 4.7).

Nhuộm tiêu bản: Tiêu bản sau khi cố định được nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram (Phụ lục A).

Hình thái vi khuẩn: Vi khuẩn bắt màu đỏ (gram âm), đa hình thái với dạng trực khuẩn ngắn, cầu trực khuẩn hay dạng sợi, kích thước từ 1 mm đến 3 mm x từ 0,4 mm đến 0,8 mm.

...

Theo đó, để làm và cố định tiêu bản thì cần dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ thu được trong mục 5.2.2 hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính. Cố định tiêu bản bằng cách để khô hoặc làm khô tiêu bản trên ngọn lửa của đèn cồn.

Tiêu bản sau khi cố định được nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát hình thái vi khuẩn.

Vi khuẩn bắt màu đỏ (gram âm), đa hình thái với dạng trực khuẩn ngắn, cầu trực khuẩn hay dạng sợi, kích thước từ 1 mm đến 3 mm x từ 0,4 mm đến 0,8 mm.

Để thực hiện phương pháp nhuộm Gram để phát hiện vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà cần những loại thuốc nhuộm nào cho quá trình thực hiện?

Theo điểm A.1 Phụ lục A Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) quy định về thuốc nhuộm dùng cho phương pháp nhuộm Gram như sau:

Phụ lục A

(Qui định)

Phương pháp nhuộm gram

A.1. Thuốc nhuộm

A.1.1. Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể 2,0 g

Etanol 95 % 20,0 ml

Amoni oxalat 0,8 g

Nước 80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2. Dung dịch fushcin gốc

Basic 1 g

fuchsin 10 ml

Etanol 95 % 5 g

Phenol Nước 100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỷ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước.

A.1.3. Dung dịch lugol

Kali iodua 2g

Iod tinh thể 1 g

Nước 200 ml

Nghiền kali iodua và iodua tinh thể, cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Cồn 95 %

...

Như vậy, để thực hiện phương pháp nhuộm Gram cần phải chuẩn bị một số thuốc nhuộm như dung dịch tím tinh thể, dung dịch fushcin gốc, dDung dịch lugol và cồn 95%.

Phương pháp nhuộm Gram được thực hiện theo trình tự như thế nào để có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh phù đầu gà?

Căn cứ điểm A.2 và điểm A.3 Phụ lục A Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) quy định về các bước thực hiện phương pháp nhuộm Gram như sau:

Phụ lục A

(Qui định)

Phương pháp nhuộm gram

...

A.2. Cách tiến hành

- Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản: từ 1 min đến 2 min

- Rửa nước nhanh, để khô

- Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min

- Rửa nước nhanh, để khô

- Nhỏ cồn 95 %

- Rửa nước thật nhanh, để khô

- Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min

- Rửa nước

- Thấm khô hoặc sấy khô

A.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (xem 4.6).

Từ tiêu chuẩn nêu trên thì trước hết cần nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản: từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Tiếp đó, nhỏ tiếp dung dịch lugol, để 1 min và tiếp tục rửa nhanh, để khô. Nhỏ tiếp cồn 95% và tiếp tục bước rửa nhanh, để khô.

Cuối cùng nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min, rửa nước và thực hiện thấm khô hoặc sấy khô tiêu bản.

Dùng 1 giọt dầu soi kính vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học để quan sát hình thái của vi khuẩn.