Để tiến hành phương pháp Realtime RT PCR thì cần xử lý mẫu bệnh phẩm từ bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh như thế nào?

Nội dung chính

• Để tiến hành phương pháp Realtime RT PCR thì cần xử lý mẫu bệnh phẩm từ bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh như thế nào?
• Để thực hiện phản ứng trong phương pháp Realtime RT PCR để phát hiện vi khuẩn gây bệnh lưỡi xanh ở bò thì cần chuẩn bị những gì?
• Tiến hành phản ứng trong phương pháp Realtime RT PCR cần thực hiện các bước như thế nào?

Để tiến hành phương pháp Realtime RT PCR thì cần xử lý mẫu bệnh phẩm từ bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh như thế nào?

Theo tiết 7.1.2 tiểu mục 7.1 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh quy định về xử lý mẫu bệnh phẩm như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

7.1.1 Lấy mẫu

Lấy mẫu theo hướng dẫn của quy trình mổ khám TCVN 8402:2010.

Mẫu bệnh phẩm: máu kháng đông, lách, hạch bạch huyết, hạch amidan, thận, dịch nổi tế bào sau khi phân lập vi rút để phát hiện vi rút. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng vi rút Bluetongue.

CHÚ THÍCH: Đối với máu chống đông dùng kim tiêm vô trùng 18G (5.1.5) lấy khoảng 5 ml máu của động vật đang sốt nghi mắc bệnh cho vào ống nghiệm có chất chống đông EDTA (4.1.1), lắc nhẹ.

Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện từ 2 °C đến 8 °C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C. Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ âm 20 °C (đối với mẫu huyết thanh) và ở âm 80 °C (đối với mẫu bệnh phẩm khác).

7.1.2 Xử lý mẫu bệnh phẩm

Tạo huyễn dịch 10% từ mẫu bệnh phẩm (lách, hạch amidan, hạch bạch huyết, thận) trong dung dịch PBS (4.1.3) vô trùng (ví dụ: nghiền 1 g mẫu bệnh phẩm trong 9 ml dung dịch PBS (4.1.3)). Sau đó ly tâm huyễn dịch 2500 g trong 15 phút bằng máy ly tâm (5.2.3). Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện vi rút Bluetongue bằng phương pháp realtime RT-PCR hoặc RT- nested PCR.

Theo đó, đối với mẫu bệnh phẩm thu được như lách, hạch amidan, hạch bạch huyết, thận thì trước tiên cần xử lý để tạo huyển dịch (10%) trong dung dịch PBS vô trùng.

Sau đó ly tâm huyễn dịch 2500 g trong 15 phút bằng máy ly tâm. Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện vi rút Bluetongue bằng phương pháp realtime RT PCR.

Để tiến hành phương pháp Realtime RT PCR thì cần xử lý mẫu bệnh phẩm từ bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh như thế nào? (Hình từ Internet)

Để thực hiện phản ứng trong phương pháp Realtime RT PCR để phát hiện vi khuẩn gây bệnh lưỡi xanh ở bò thì cần chuẩn bị những gì?

Theo tiết 7.2.1.1 tiểu mục 7.2 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh quy định về việc chiết tách ARN khi thực hiện phương pháp Realtime RT PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

7.2 Phát hiện kháng nguyên

7.2.1 Phương pháp realtime RT-PCR

7.2.1.1 Chiết tách ARN

- Sử dụng kít chiết tách ARN vi rút Bluetongue theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 1), hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách ARN vi rút (tham khảo Phụ lục B).

- ARN vi rút sau khi chiết tách được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

...

Như vậy, trước khi tiến hành phản ứng thì cần chiết tách ARN từ mẫu dịch nổi thu được sau khi xử lý mẫu bệnh phẩm.

ARN vi rút sau khi chiết tách được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

Tiến hành phản ứng trong phương pháp Realtime RT PCR cần thực hiện các bước như thế nào?

Theo tiết 7.2.1.2 tiểu mục 7.2 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh thì các bước tiến hành phản ứng Realtime RT PCR như sau:

- Chuẩn bị mồi và đoạn dò cho phản ứng realtime RT-PCR: Trình tự mồi và đoạn dò để phát hiện vi rút Bluetongue.

CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi và đoạn dò cần tham khảo khuyến cáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn phù hợp.

- Tiến hành phản ứng realtime RT-PCR: Sử dụng cặp mồi và đoạn dò với nồng độ thích hợp (tham khảo bảng C.2, phụ lục C) đã chuẩn bị và bộ kít pha hỗn hợp phản ứng (master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng kít Master mix SuperScript ® III Platinum ® One step Quantitative RT-PCR system 2), Cat. No.: 11732-020 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi công thức master mix).

- Lượng hỗn hợp nhân gen cho 1 phản ứng.

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu master mix tiến hành:

+ Cho 20μl hỗn hợp master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 μl ARN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng realtime PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl ARN dương chuẩn của vi rút Bluetongue (mẫu ARN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút Bluetongue) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng realtime PCR.

- Kết quả của phản ứng realtime RT-PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct.

Với điều kiện phản ứng:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct ≤ 37

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 37 < Ct ≤ 45

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh lưỡi xanh khi kết quả của phương pháp realtime RT PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.