Dùng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn thì cần dùng những nguyên liệu nào?

Nội dung chính

• Dùng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn thì cần dùng những nguyên liệu nào?
• Tiến hành phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn được thực hiện như thế nào?
• Kết quả của phương pháp PCR như thế nào thì kết luật mẫu bệnh phẩm dương tính với bệnh phó thương hàn lợn?

Dùng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn thì cần dùng những nguyên liệu nào?

Dùng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn thì cần dùng những nguyên liệu nào? (Hình từ Internet)

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-19:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn quy định về thuốc thử và vật liệu thử như sau:

Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng, trừ khi có quy định khác.

3.1. Môi trường thạch máu: Thạch máu cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

3.2. Môi trường nước thịt

3.3. Thạch MacConkey hay thạch Brilliant green (BG) hoặc môi trường thạch XLD (xylose-lysine-deoxycholate agar).

3.4. Nước peptone (peptone water).

3.5. Bộ kháng huyết thanh chuẩn đơn giá và đa giá định typ kháng nguyên vi khuẩn Salmonella.

3.6. Nguyên liệu hóa chất cho các phản ứng sinh hóa (Phụ lục A).

3.7. Nguyên liệu cho PCR (Phụ lục B).

Dẫn chiếu điểm B.1 Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-19:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn quy định về nguyên liệu cho phương pháp PCR như sau:

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

B.1 Nguyên liệu PCR

B.1.1 Taq PCR Master Mix Kit (kit thương mại)

B.1.2 Cập mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2).

B.1.3 Nước tinh khiết không có nuclease

B.1.4 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

B.1.5 Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

B.1.6 Loading dye

B.1.7 DNA chuẩn (Ladder, marker)

Từ tiêu chuẩn nêu trên thì khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn thì có thể sử dụng những nguyên liệu sau:

- Taq PCR Master Mix Kit (kit thương mại)

- Cập mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2).

- Nước tinh khiết không có nuclease

- Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

- Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

- Loading dye

- DNA chuẩn (Ladder, marker)

Ngoài ra, trong việc chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn bằng phương pháp PCR thì phải sử dụng thêm một số thuốc thử và vật liệu thử sau:

- Môi trường thạch máu: Thạch máu cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

- Môi trường nước thịt

- Thạch MacConkey hay thạch Brilliant green (BG) hoặc môi trường thạch XLD (xylose-lysine-deoxycholate agar).

- Nước peptone (peptone water).

- Bộ kháng huyết thanh chuẩn đơn giá và đa giá định typ kháng nguyên vi khuẩn Salmonella.

Tiến hành phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn được thực hiện như thế nào?

Theo điểm B.3, B.4 và điểm B.5 Phục lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-19:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn quy định về các bước tiến hành phương pháp PCR như sau:

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

...

B.3. Tách chiết DNA

Các vi chuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hay bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nước trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

B.4. Phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi ở Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:

- Taq PCR Master Mix Kit 12,5 μl

- Mồi xuôi 20 μM 1 μl

- Mồi ngược 20 μM 1 μl

- Nước không có nuclease 8,5 μl

- Mẫu DNA 2 μl

Tổng thể tích 25 μl

Chu trình nhiệt trong Bảng 2.

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn Salmonella (xem B.2).

Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn.

B.5. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml.

Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).

...

Như vậy, để tiến hành phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phó thương hàn lợn thì cần tiến hành các bước như tách chiết ADN, thực hiện phản ứng PCR và chạy điện di sản phẩm PCR theo tiêu chuẩn nêu trên.

Kết quả của phương pháp PCR như thế nào thì kết luật mẫu bệnh phẩm dương tính với bệnh phó thương hàn lợn?

Theo điểm B.6 Phụ Lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-19:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn quy định về kết quả của phản ứng PCR như sau:

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

...

B.6. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra: Có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra: Không xuất hiện vạch.

Có thể kết luận dương tính với bệnh phó thương hàn lợn khi mẫu đối chứng Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm và mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.