TCVN 8400-46:2019 quy trình chuẩn đoán bệnh dại ở động vật như thế nào? Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm ở động vật như thế nào?

Nội dung chính

• Triệu chứng lâm sàng về bệnh dại ở động vật là chó như thế nào?
• Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm ở động vật như thế nào?
• Hướng dẫn phát hiện bệnh dại ở động vật bằng phương pháp realtime RT-PCR?

Triệu chứng lâm sàng về bệnh dại ở động vật là chó như thế nào?

Tại tiểu mục 5.2.1 Mục 5.2 TCVN 8400-46:2019 có nêu rõ về triệu chứng lâm sàng về bệnh dại ở động vật là chó như sau:

(1) Thể dại điên cuồng

Giai đoạn ủ bệnh: thông thường từ 2 đến 3 tuần (chiếm 98 % các trường hợp), tối đa là 6 tháng, giai đoạn này không có các biểu hiện lâm sàng.

Giai đoạn tiền triệu hoặc khởi phát: rất khó phát hiện, chó có các biểu hiện khác thường, chủ yếu thay đổi về tính nết như trốn vào một góc tối, biểu hiện vui mừng hơn bình thường, thỉnh thoảng cắn, sủa vu vơ lên không khí (đớp mồi), vẻ bồn chồn.

Giai đoạn kích thích:

- Biểu hiện chính của thời kỳ này là các phản xạ thông thường của chó bị kích thích mạnh như: đang ngồi dưới đất bỗng đứng dậy, nhảy lên, thấy người lạ xông ra cắn sủa dữ dội, chó có phản ứng quá mức đối với tiếng động và ánh sáng.

- Chó bỏ ăn, nuốt khó khăn, phải vươn cổ ra để nuốt, cắn các vật lạ, khát nước, uống liên tục nhưng chỉ uống được ít.

- Chó bắt đầu chảy nước dãi, sùi bọt mép.

Sau khi phát bệnh 2 đến 3 ngày:

- Con vật có biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh Dại: mắt đỏ ngầu, hai tai dựng ngược, mồm há hốc ra, hàm dưới trễ hẳn xuống, nước dãi chảy thành dòng, bụng thóp lại.

- Tiếng sủa đặc trưng: dây thần kinh họng bắt đầu bị liệt, chó phát ra tiếng hú nghe như thiếu hơi, xa xôi.

Giai đoạn bại liệt:

- Con vật bị liệt mặt không ăn và nuốt được, nước bọt chảy ra nhiều, hàm dưới trễ hẳn xuống, sau đó liệt các cơ vận động và chết do liệt hô hấp hoặc vì kiệt sức do sự vận động của cơn Dại và không ăn uống gì.

(2) Thể dại bại liệt

Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2°C đến 8 °C (4.1.11) và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 h.

CHÚ Ý:

- Tất cả các mẫu phải được dán nhãn và kèm theo các thông tin dịch tễ đầy đủ.

- Trong trường hợp không tiến hành xét nghiệm ngay thì mẫu phải được bảo quản ở tủ - 20 °C (4.1.10).

- Mẫu ban đầu và rác thải xuất hiện trong quá trình chẩn đoán bệnh Dại phải được phân loại (4.1.6), tiến hành hấp tiệt trùng (4.1.8) và cho vào thùng rác y tế.

TCVN 8400-46:2019 quy trình chuẩn đoán bệnh dại ở động vật như thế nào? Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm ở động vật như thế nào? (Hình từ Interenet)

Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm ở động vật như thế nào?

Tại tiểu mục 6.1 Mục 6 TCVN 8400-46:2019 có nêu rõ lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm ở động vật như sau:

Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên

- Sơ đồ chẩn đoán bệnh Dại (xem Phụ lục D): Tất cả các thao tác liên quan đến việc chẩn đoán bệnh Dại như xử lý mẫu, chiết tách ARN, phân lập vi rút Dại trong tiêu chuẩn này phải được tiến hành trong tủ an toàn sinh học cấp 2 (BSC-2) (4.1.7) trở lên, tại phòng an toàn sinh học cấp 3 (BSL-3). Chỉ sau khi vi rút được bất hoạt hoặc thao tác với chủng CVS mới thực hiện tiếp các phương pháp tại phòng an toàn sinh học cấp 2 (BSL- 2).

- Tại các cơ sở chưa đạt yêu cầu chẩn đoán bệnh Dại, muốn xét nghiệm kháng nguyên bệnh Dại thì lấy mẫu đầu của động vật nghi mắc bệnh Dại gửi đến cơ sở đạt yêu cầu chẩn đoán bệnh Dại để xét nghiệm.

- Tại các cơ sở đạt yêu cầu chẩn đoán bệnh Dại, mẫu bệnh phẩm xét nghiệm bệnh Dại là mẫu đầu hoặc 3-5 gram mẫu mô não (sừng ammon, thân não, đồi thị, vỏ não) của con vật nghi mắc bệnh Dại.

- Mẫu bệnh phẩm phải bao gói cẩn thận tránh lây lan, bảo quản ở nhiệt độ âm sâu (4.1.10) hoặc ít nhất từ 2°C đến 8 °C (4.1.11) và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 h.

CHÚ Ý:

- Tất cả các mẫu phải được dán nhãn và kèm theo các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích (nếu mổ khám).

- Trong trường hợp không tiến hành xét nghiệm mẫu ngay thì mẫu xét nghiệm kháng nguyên phải được bảo quản trong tủ -80 °C (4.1.10)

- Mẫu ban đầu và rác thải xuất hiện trong quá trình chẩn đoán bệnh Dại phải được phân loại, tiến hành hấp tiệt trùng và cho vào thùng rác y tế.

Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể:

- Sử dụng xi lanh 5 ml để lấy 1 ml máu, rút cán xi lanh tới mức cao nhất để tạo nhiều khoảng trống bên trong, đặt xi lanh nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ 20 °C đến 30 °C trong thời gian 30 phút để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh. Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm.

- Bệnh Dại lưu hành ở trên 150 nước trên thế giới với 3,3 tỷ dân sinh sống tại các vùng dịch lưu hành, chủ yếu ở các nước thuộc khu vực châu Á, châu Phi và châu Mỹ La tinh. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hằng năm có khoảng 60 000 người chết vì bệnh Dại (99 % người chết này là do lây truyền vi rút Dại từ chó) và 15 triệu người bị phơi nhiễm vi rút Dại phải đi điều trị dự phòng.

Bệnh Dại có 2 thể lâm sàng:

- Thể dại điên cuồng

- Thể dại bại liệt (hay thể dại câm)

Hướng dẫn phát hiện bệnh dại ở động vật bằng phương pháp realtime RT-PCR?

Căn cứ theo tiểu mục 6.2.3 Mục 6 TCVN 8400-46:2019 có nêu rõ hướng dẫn phát hiện bệnh dại ở động vật bằng phương pháp realtime RT-PCR như sau:

Chuẩn bị mẫu

- Nghiền 1 gram bệnh phẩm mẫu não trong ống nghiền mẫu (4.4.1) với dung dịch PBS pH 7,2 (3.2.14) theo tỉ lệ 1:10.

- Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc (xem A1 phụ lục A), chuyển sang ống ly tâm. Ly tâm ở gia tốc 8000 g trong 15 min (4.4.2).

- Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào 2 ống 1,5 ml. Một ống dùng cho các xét nghiệm realtime RT-PCR (rRT-PCR), ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ - 80 °C (4.1.10).

Cách tiến hành

(1) Chiết tách ARN

Sau khi xử lý mẫu, tiến hành chiết tách ARN từ các dịch bệnh phẩm bằng kít thương mại (3.3.1) (xem phụ lục B). ARN thu được sau quá trình chiết tách dùng làm mẫu xét nghiệm.

(2) Tiến hành phản ứng

Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút Dại trên cơ sở phát hiện gen N được thực hiện như sau:

- Lựa chọn mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime RT-PCR: cần tham khảo các báo cáo giám sát để biết để lựa chọn mồi và mẫu dò phù hợp với các chủng vi rút đang lưu hành. Các bộ mồi và mẫu dò để phát hiện các chủng vi rút Dại lưu hành được nêu trong Bảng C.1 và C.4 phụ lục C.

- Chuẩn bị mồi như trích dẫn trong phụ lục C với nước sạch không chứa DNase/Rnase (3.3.4).

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút Dại theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng (xem Phụ lục C).

(3) Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) có giá trị Ct ≤ 25, (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct.

Với điều kiện như trên:

- Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính.

- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính.

- Mẫu có giá trị 35< Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp tương đương khác (phân lập vi rút hoặc DFAT) để khẳng định kết quả.