Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 yêu cầu về môi trường nuôi cấy và thuốc thử theo phương pháp phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt?

Nội dung chính

• Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 yêu cầu về môi trường nuôi cấy và thuốc thử theo phương pháp phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt?
• Việc lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 như thế nào?
• Cách tiến hành phương pháp phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt như thế nào?

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 yêu cầu về môi trường nuôi cấy và thuốc thử theo phương pháp phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt?

Tại Mục 5 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 yêu cầu về môi trường nuôi cấy và thuốc thử theo phương pháp phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt như sau:

* Yêu cầu chung

Để thực hành trong phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).

* Môi trường canh thang dinh dưỡng

- Xem C.1.

* Môi trường thạch dinh dưỡng, thạch dinh dưỡng bổ sung 0,7 %natri bicacbonat

- Xem C.2.

* Môi trường thạch máu

- Xem C.3.

* Huyết thanh lắng cặn (kháng thể chuẩn), kháng nguyên âm tính chuẩn và kháng nguyên dương tính chuẩn (vacxin Sterne)

Kháng thể chuẩn được chuẩn bị từ thỏ bằng cách tiêm vacxin Sterne dưới da vào ngày thứ nhất và ngày thứ 14.

* Nước muối đẳng trương

- Xem C.4.

* Thuốc nhuộm gram

- Xem C,5.

* Thuốc nhuộm Wright

- Xem C.6.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 yêu cầu về môi trường nuôi cấy và thuốc thử theo phương pháp phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt? (Hình từ Internet)

Việc lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 như thế nào?

Tại Mục 7 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 yêu cầu về việc lấy mẫu như sau:

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 7925:2008 (ISO 17604:2003) và các tiêu chuẩn cụ thể có liên quan.

Điều quan trọng là mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và mẫu không bị thay đổi hoặc thay đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Tại Mục 8 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 yêu cầu về việc chuẩn bị mẫu thử như sau:

- Nguyên tắc chung

Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật theo TCVN 6507-2:2005 (ISO 6887-2:2003).

- Chuẩn bị mẫu các sản phẩm cụ thể

+ Sản phẩm tươi sống

Đối với mẫu thử là hạch thì bổ đôi hạch, còn các mẫu thử khác thì dùng dao mổ (6.3) đã hơ nóng trên ngọn lửa, áp nhanh lên mặt (chỗ có bệnh tích), trích sâu mũi dao vào vùng đã xử lý, dùng que cấy (6.2) lấy mẫu.

+ Sản phẩm khác (kể cả sừng, rơm, cỏ)

Cân từ 5 g đến 10 g mẫu thử, cắt hoặc nghiền vụn thành mảnh, hạt nhỏ, ngâm trong 5 phần đến 10 phần nước muối đẳng trương vô khuẩn (5.6), để trong nhiệt độ phòng từ 4 h đến 5 h và cứ sau 30 min thì lắc nhẹ trong 2 min đến 3 min. Thu lấy lớp nước trong. Nếu nghi ngờ bị nhiễm tạp khuẩn thì đun nóng trên nồi cách thủy ở 65oC (6.1) trong 15 min đến 30 min.

Chú thích: Có thể dùng que tăm bông ướt vô khuẩn quét trên mặt mẫu thử (ở các vị trí khác nhau và cả hai mặt) rồi chuyển tăm bông vào bình đã đựng sẵn từ 20 ml đến 50 ml môi trường nước thịt, ủ ở 37oC trong 24h.

Cách tiến hành phương pháp phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt như thế nào?

Tại Mục 9 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009 quy định về cách tiến hành như sau:

- Yêu cầu chung

Dụng cụ, môi trường, thao tác phải vô khuẩn, đảm bảo an toàn, không gây ô nhiễm. Thực hiện trong phòng thử nghiệm thông thường, xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).

- Ủ và cấy

Sử dụng que cấy vòng vô trùng hoặc tăm bông (6.2) ria cấy dung dịch huyền phù ban đầu hoặc mẫu máu, dịch lấy từ vết rạch của mô hoặc phủ tạng lên môi trường thạch dinh dưỡng và thạch máu (5.3 và 5.4), mỗi loại hai đĩa. Cho vào môi trường polymyxin (100 000 UI/I) để giảm sự nhiễm khuẩn và giúp phân lập được B. anthracis.

- Nhận dạng B. anthracis

Ủ các đĩa đã cấy ở 37oC qua đêm để phát hiện sự có mặt các khuẩn lạc B. anthracis giả định theo các đặc trưng của chúng. Tiến hành nhuộm Gram và Wright.

Giáp mô là yếu tố độc lực của vi khuẩn, có tác dụng ngăn cản khả năng thực bào; chỉ được hình thành trong cơ thể gia súc bị bệnh, đặc tính này có thể mất đi nếu nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường nhân tạo ở điều kiện hiếu khí. Giáp mô được sinh ra khi nuôi cấy vi khuẩn B. anthracis có độc lực ít nhất 5 h trong môi trường máu ngựa đã tách fibrin hoặc môi trường có bổ sung natri bicacbonat 0,7 % (5.3) ở nhiệt độ 37oC có bổ sung khí CO2 20 %. Vi khuẩn B. anthracis có giáp mô sẽ hình thành những khuẩn lạc nhầy.

Chú thích: Có thể dùng tăm bông ướt vô trùng quét lên mặt mẫu thử (ở các vị trí khác nhau và cả hai mặt) rồi chuyển tăm bông vào bình chứa 20 ml đến 50 ml canh thang dinh dưỡng (5.2), ủ ở 37oC trong 24h.

Trên môi trường thạch dinh dưỡng hay thạch máu (5.3): hình thành khuẩn lạc mờ, khá phẳng, gần giống B. cereus nhưng kích thước nhỏ hơn, khoảng từ 0,3 cm đến 0,5 cm, nhầy và dính hơn, trên thạch máu có màu trắng xám hoặc xám và rìa mép lạc thường hình thành các sợi dài giống như sợi tóc xoăn.

Ria cấy trên môi trường mạch máu, thạch dinh dưỡng, mỗi loại 2 đĩa, ủ ở 37oC trong 24h, đọc kết quả và làm đồ phiến nhuộm Gram, Wright.

Khuẩn lạc B. anthracis điển hình cho thấy có dạng hình tròn, to, màu trắng đục, ướt nhầy, rìa mép nhăn theo. Qua kính hiển vi (6.6) thấy hình sóng, chung quanh có nếp xoăn như tóc uốn, không tan máu. Trên lam kính, vi khuẩn có nha bào hình bầu dục giữa thân.

Chọn những khuẩn lạc điển hình ở trên, cấy truyền sang môi trường nước thịt, ủ ở 37oC trong 18h đến 24h; đọc kết quả và làm đồ phiến nhuộm Gram, Wright kiểm tra tính thuần khiết. Trong nước sẽ có những sợi xốp như bông, màu trắng đục, sau lắng xuống đáy ống, phần nước phía bên trong. Nếu có lẫn tạp khuẩn thì ria cấy lại trên môi trường thạch.

- Thử khẳng định bằng cách tiêm động vật thí nghiệm

Mỗi mẫu thử dùng 2 chuột nhắt trắng, nặng từ 18g đến 20g. Tiêm dưới da bụng con chuột 0,1 ml dịch cấy trong 9.2.

Thông thường sau 12h đến 24h, chuột có triệu chứng ủ rũ, lưng còng, lông xù lên và chết sau 24h đến 96h; bệnh tích xuất hiện dưới da và thủy thũng vùng tiêm, lách sưng. Nếu cần, kiểm tra lại hình dạng vi khuẩn, đặc tính sinh trưởng và thử phản ứng lắng cặn (phản ứng Ascoli).

Chú thích 1 Có thể dùng huyễn dịch mẫu thử (từ 1:5 đến 1:10) với liều tiêm gấp đôi thay cho canh trùng.

Chú thích 2 Nếu mẫu thử nghi ngờ bị nhiễm tạp khuẩn thì dùng phương pháp rạch da chuột, xát mẫu thử hoặc canh khuẩn lên chỗ rạch thay cho tiêm dưới da.

Chú thích 3 Những lô chuột chết do tiêm mẫu nước, rơm, cỏ cần thử phản ứng lắng cặn (phản ứng Ascoli).

- Thử khẳng định bằng phản ứng lắng cặn (phản ứng Ascoli)

+ Chuẩn bị mẫu thử (kháng nguyên)

++ Sản phẩm tươi sống

Dùng cân (6.9) cân từ 5g đến 10g mẫu, nghiền nhuyễn mẫu bằng dụng cụ nghiền phòng thử nghiệm (6.5), pha loãng bằng nước muối đẳng trương (5.6) thành dung dịch 1:5 đến 1:10. Đun sôi cách thủy từ 15 min đến 30 min. Lọc qua giấy lọc (6.10) thu lấy dịch trong.

++ Sản phẩm khác (các sản phẩm khác của động vật)

Dùng cân (6.9) cân từ 5g đến 10g xương, sừng, lông hoặc 15 cm2 đến 25 cm2 da, hấp ướt ở 102oC trong 30 min đến 60 min; để nguội cắt nhỏ hoặc nghiền vụn, hòa trộn trong 5 phần đến 10 phần nước muối đẳng trương (5.6). Đun sôi cách thủy từ 15 min đến 30 min. Lọc qua giấy lọc (6.10), thu lấy phần dịch trong.

+ Cách tiến hành

Trong ống nghiệm cỡ nhỏ hoặc ống nghiệm chuyên dụng đã chứa sẵn 0,5 ml huyết thanh lắng cặn (5.5); dùng pipet Pasteur (6.11) lấy 0,5 ml kháng nguyên (9.5.1), nhỏ từ từ theo thành ống để kháng nguyên không bị hòa tan trong huyết thanh, có đường ranh giới rõ rệt. Mỗi lần kiểm nghiệm cần kèm theo 2 ống đối chứng dương tính và âm tính.

Đọc kết quả sau 1 min đến 15 min. Nếu đường ranh giới xuất hiện vòng trắng đục chứng tỏ kết quả dương tính.