Kết quả chạy điện di trên mẫu thử như thế nào thì kết luận tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy? Cần sử dụng cặp mồi nào khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm?

Nội dung chính

• Cần sử dụng cặp mồi nào khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm?
• Thực hiện chạy điện di bằng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm như thế nào?
• Kết quả chạy điện di trên mẫu thử như thế nào thì kết luận tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy?

Cần sử dụng cặp mồi nào khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm?

Theo tiết 3.2.1.5.2.1 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về cặp mồi dùng trong phương pháp PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.2. Tiến hành phản ứng PCR

3.2.1.5.2.1. Cặp mồi ngoài sử dụng trong phản ứng PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt theo phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi Pf -1, Pr -1, xem Bảng 1.

Cặp mồi Pf -1/Pr -1 dùng để khuếch đại đoạn DNA của vi khuẩn NHP có kích thước 441 bp.

Chuẩn bị mồi:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease hoặc đệm TE (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

Theo đó, cần sử dụng cặp mồi Pf-1 hoặc Pr-1 để tiến hành phương pháp PCR.

Mồi phải ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm gốc.

Sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease hoặc đệm TE (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

Kết quả chạy điện di trên mẫu thử như thế nào thì kết luận tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy? Cần sử dụng cặp mồi nào khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm? (Hình từ Internet)

Thực hiện chạy điện di bằng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm như thế nào?

Theo tiết 3.2.1.5.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về việc thực hiện chạy điện di đối với mẫu thử như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.3. Chạy điện di

3.2.1.5.3.1. Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì cho vào 5 µl etidi bromua vào mỗi 100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn.

Tiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm.

Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.1.5.3.2. Điện di

Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.

Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo DNA marker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang DNA vào một giếng trên bản gel.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agarose, dừng quá trình điện di.

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl đệm tải mẫu 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel."

Theo đó, để thực hiện chạy điện di thì cần chuẩn bị bản gel, thực hiện pha bản gel theo tiêu chuẩn nêu trên.

Thực hiện điện di ở hiệu điện thế 100V đến 150V (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agarose, dừng quá trình điện di.

Kết quả chạy điện di trên mẫu thử như thế nào thì kết luận tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy?

Theo tiết 3.2.1.5.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về kết quả sau khi chạy điện di như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.4. Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.

Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 441bp. Thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm thanh không có vạch sáng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi: Không có vạch sáng kích thước 441bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, thang DNA phân vạch rõ ràng.

Như vậy, sau khi chạy điện di trên mẫu thử thì có thể kết luận tôm mắc bệnh hoại tử gan tuy nếu trên mẫu thử xuất hiện những dấu hiệu sau:

- Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 441bp.

- Thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm thanh không có vạch sáng.

Trường hợp mẫu thử không có vạch sáng kích thước 441bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, thang DNA phân vạch rõ ràng.thì tôm không nhiễm bệnh hoại tử gan tụy.