Kết quả phản ứng Realtime PCR như thế nào thì có thể kết luật tôm sú nhiễm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính?

Nội dung chính

• Cặp mồi dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm là cặp mồi nào?
• Phản ứng Realtime PCR để phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong phương pháp Realtime PCR được thực hiện như thế nào?
• Kết quả phản ứng Realtime PCR như thế nào thì có thể kết luật tôm sú nhiễm bệnh toại tử gan tụy cấp tính?

Cặp mồi dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm là cặp mồi nào?

Theo tiết 6.2.3.4 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về tiến hành phản ứng trong phương pháp Realtime PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm

...

6.2.3.4 Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục E.

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng cặp mồi và mẫu dò VpPirA.

Chuẩn bị các mồi và mẫu dò ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase (4.3.4).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng, Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-0172) của hãng Invitrogen

LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

...

Theo đó, để tiến hành phản ứng trong phương pháp Realtime PCR dùng thì cần sử dụng đến cặp mồi VpPirA.

Cặp mồi phải được giữ ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase.

Kết quả phản ứng Realtime PCR như thế nào thì có thể kết luật tôm sú nhiễm bệnh toại tử gan tụy cấp tính? (Hình từ Internet)

Phản ứng Realtime PCR để phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong phương pháp Realtime PCR được thực hiện như thế nào?

Theo Phục lục E2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về quy trình thực hiện phản ứng Realtime PCR như sau:

E.2 Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và đoạn dò đã được chuẩn bị và kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng E.2.

VÍ DỤ: sử dụng bộ kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen.

- Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 µl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có ADNse/RNase vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (20 µl hỗn hợp Master mix và 5 µl) vào máy realtime PCR và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng realtime PCR.

Theo đó, quy trình thực hiện phản ứng Realtime PCR được thực hiện theo các bước tại Tiêu chuẩn nêu trên.

Kết quả phản ứng Realtime PCR như thế nào thì có thể kết luật tôm sú nhiễm bệnh toại tử gan tụy cấp tính?

Theo tiết 6.2.3.5 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về kết quả phản ứng PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm

...

6.2.3.5 Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct). Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct dao động trong khoảng ± 2 Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó.

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct < 35 được coi là dương tính. Mẫu không có giá trị Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 ≤ Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.

Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

Như vậy, điều kiện phản ứng được công nhận là mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct). Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct dao động trong khoảng ± 2 Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó.

Dựa theo điều kiện trên thì mẫu có giá trị Ct < 35 được coi là dương tính. Mẫu không có giá trị Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 ≤ Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.