Khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu thì mẫu bệnh phẩm dùng chẩn đoán cần bảo quản như thế nào?

Nội dung chính

• Khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu thì mẫu bệnh phẩm dùng chẩn đoán cần bảo quản như thế nào?
• Thực hiện tách chiết ADN bằng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu theo quy trình nào?
• Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus gồm những thiết bị dụng cụ nào?

Khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu thì mẫu bệnh phẩm dùng chẩn đoán cần bảo quản như thế nào?

Theo tiết 6.2.2 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ quy định về việc bảo quản mẫu bệnh pháp khi áp dụng phương pháp PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

6.2.1. Lấy mẫu

Xem 6.1 1.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối (3.2.1);

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 60 °C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.2.1).

...

Theo Tiêu chuẩn nêu trên thì mẫu bệnh phẩm dùng cho việc chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối.

Mẫu bệnh phẩm được chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 60 °C hoặc trong etanol tuyệt đối.

Áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu (Hình từ Internet)

Thực hiện tách chiết ADN bằng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu theo quy trình nào?

Theo Phụ lục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ quy định về trình tự tách chiết ADN ở hàu bằng phương pháp PCR như sau:

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) và protein K ủ qua đêm ở 56 °C như sau:

- Nhỏ 20 ml protein K vào ống ly tâm 1,5 ml;

- Chuyển 30 mg mẫu bệnh phẩm (6.2.3) vào ống ly tâm đã có protein K:

- Thêm 200 ml dung dịch AL (Lysis buffer);

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4);

- Ủ qua đêm ở 56 °C trong bể ủ nhiệt (4.2.5), sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4);

- Thêm 200 ml etanol tuyệt đối (3.2.1) vào ống ly tâm;

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4);

- Hút 420 ml huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 ml dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm;

- Thêm 500 ml dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g (14 000 r/min) trong 3 min ở nhiệt độ phòng:

- Chuyển cột ly tâm sang ống eppendorf 1,5 ml;

- Nhỏ 200 ml dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm bằng máy Iy tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min;

- Chuyển 200 ml ADN đã thu được sang ống eppendorf 1,5 ml khác.

Bảo quản ADN ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h.

Như vậy, quy trình tách chiết ADN ở hàu bằng phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus thì cần thực hiện theo trình tự nêu trên.

Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus gồm những thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ quy định về thiết bị, dụng cụ dùng trong phương pháp PCR như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng cho phương pháp nuôi cấy.

4.1.1. Nồi hấp vô trùng, có thể duy trì ở nhiệt độ 115 °C.

4.1.2. Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20 X, 40 X và 100 X.

4.1.3. Ống nghiệm vô trùng, dung tích 15 ml.

4.1.4. Phiến kính vô trùng.

4.1.5. Lamen vô trùng.

4.1.6. Dao mổ, panh, kéo vô trùng.

4.1.7. Pipet pasteur.

4.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR

4.2.1. Máy nhân gen (PCR).

4.2.2. Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

4.2.3. Máy lắc trộn vortex.

4.2.4. Máy spindown.

4.2.5. Bể ủ nhiệt, duy trì nhiệt độ từ 55 °C đến 60 °C.

4.2.6. Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.2.7. Máy đọc gel.

4.2.8. Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml.

Theo đó, thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp PCR gồm

- Máy nhân gen (PCR).

- Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

- Máy lắc trộn vortex.

- Máy spindown.

- Bể ủ nhiệt, duy trì nhiệt độ từ 55 °C đến 60 °C.

- Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

- Máy đọc gel.

- Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml.