Khi áp dụng phương pháp rRT-PCR để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thì thực hiện tách chiết ARN?

Nội dung chính

• Phương pháp rRT-PCR để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được thực hiện theo nguyên tắc nào?
• Khi áp dụng phương pháp rRT-PCR để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thì thực hiện tách chiết ARN?
• Phương pháp rRT-PCR cho kết quả như thế nào thì kết luật mẫu bệnh phẩm dương tính với hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn?

Phương pháp rRT-PCR để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được thực hiện theo nguyên tắc nào?

Theo tiết 5.2.2.2.1 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) quy định về nguyên tắc chẩn đoán của phương pháp rRT-PCR như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.2.2.1. Nguyên tắc

Phản ứng rRT-PCR dùng để phát hiện ARN của vi rút PRRS. Phản ứng này có thể phân biệt vi rút PRRS thuộc chủng Châu Âu, Bắc Mỹ và Trung Quốc (vi rút PRRS độc lực cao) bằng việc sử dụng các cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu.

Danh mục các mẫu dò và cặp mồi sử dụng cho phản ứng rRT-PCR trong quy trình này để phát hiện vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ (NA), Châu Âu (EU) và Trung Quốc

Theo đó nguyên tắc chẩn đoán của phương pháp rRT-PCR dựa trên Phản ứng rRT-PCR để phát hiện ARN của vi rút PRRS gây nên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.

Phản ứng này có thể phân biệt vi rút PRRS thuộc chủng Châu Âu, Bắc Mỹ và Trung Quốc (vi rút PRRS độc lực cao) bằng việc sử dụng các cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu.

Khi áp dụng phương pháp rRT-PCR để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thì thực hiện tách chiết ARN?

Theo điểm B.1 Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) quy định về việc tách chiết ARN trong phương pháp rRT-PCR như sau:

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Phương pháp rRT-PCR phát hiện ARN của vi rút PRRS

B.1. Chiết tách ARN

Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Nếu sử dụng kít chiết tách Qiagen RNearsy minikit thì các bước chiết tách được thực hiện như sau:

a) Chuẩn bị

Chuẩn bị dung dịch RLT (600 μl/mẫu) vào ống ly tâm 50 ml vô trùng (xem 4.14). Thêm 1/100 β- mercaptoetanol (β-ME) vào dung dịch RLT (sau khi bổ sung β-ME, dung dịch RLT này có thể giữ được 1 tháng ở nhiệt độ phòng).

b) Tiến hành chiết tách

Lắc mẫu trong 5 s bằng máy lắc rồi ly tâm nhanh. Cho 600 μl dung môi RLT đã bổ sung β-ME vào ống giữ mẫu 1,5 ml (xem 4.23).

Chuyển 200 μl mẫu sang ống giữ mẫu 1,5 ml (xem 4.23). Lắc ống 1,5 ml bằng máy lắc trong 15 s và ly tâm nhanh.

Thêm 400 μl ethanol 100 % (cồn tuyệt đối) và lắc trong 15 s. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.

Chuyển 600 μl hỗn hợp dung dịch ở trên vào ống cột lọc (spin column) có trong bộ kit. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min. Vứt bỏ phần ống thu dung dịch ở dưới, chuyển phần cột lọc phía trên sang ống thu mới. Chuyển nốt 600 μl hỗn hợp dung dịch còn lại vào trong cột lọc. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min.

Vứt bỏ phần ống thu dung dịch ở dưới, chuyển phần cột lọc phía trên sang ống thu mới.

Rửa lần 1: Cho 700 μl dung dịch RW1 vào cột lọc. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min.

Vứt bỏ phần ống thu dung dịch ở dưới, chuyển phần cột lọc phía trên sang ống thu mới.

Rửa lần 2: Cho 500 μl dung dịch RPE vào cột lọc, ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min. Đổ bỏ phần dung dịch ở dưới, giữ lại ống thu, cho tiếp 500μl dung dịch RPE vào cột lọc, ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min.

Đặt cột lọc vào ống thu mới. Ly tâm cột lọc ở gia tốc 14 000g trong 2 min.

Thu ARN: Chuyển cột lọc sang ống giữ mẫu 1,5 ml mới. Cho 50 μl nước không chứa nuclease vào cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 1 min ở gia tốc lớn hơn 10 000g.

Chuyển mẫu ARN đã thu sang ống giữ mẫu 1,5 ml mới.

Cất giữ ARN: Có thể giữ ARN ở 4 °C trong vài giờ nếu sử dụng ngay hoặc cất giữ ở nhiệt độ - 20 °C nếu chưa dùng ngay trong ngày.

...

Theo đó bước tách chiết ARN cần chuẩn bị dung dịch RLT (600 μl/mẫu) vào ống ly tâm 50 ml vô trùng. Thêm 1/100 β- mercaptoetanol (β-ME) vào dung dịch RLT (sau khi bổ sung β-ME, dung dịch RLT này có thể giữ được 1 tháng ở nhiệt độ phòng) để thực hiện các bước tách chiết theo tiêu chuẩn nêu trên.

Sau khi thu được ARN cần cất giữ ARN ở 4 °C trong vài giờ nếu sử dụng ngay hoặc cất giữ ở nhiệt độ - 20 °C nếu chưa dùng ngay trong ngày.

Khi áp dụng phương pháp rRT-PCR để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thì thực hiện tách chiết ARN? (Hình từ Internet)

Phương pháp rRT-PCR cho kết quả như thế nào thì kết luật mẫu bệnh phẩm dương tính với hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn?

Theo tiết 5.2.2.2.3 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) quy định về kết quả của phương pháp rRT-PCR như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.2.2.3. Đánh giá kết quả

Kết quả chạy rRT - PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Ct) phát hiện tín hiệu huỳnh quang.

- Mẫu được coi là dương tính khi có Ct ≤ 35.

- Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct.

- Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35, trường hợp này phải xét nghiệm lại hoặc dùng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng định.

...

Nếu kết quả chẩn đoán có Ct ≤ 35 thì mẫu được coi là dương tính, trường hợp kết quả không có Ct thì mẫu được coi là âm tính.

Ngoài ra, nếu kết quả cho Ct >35 thì được xem là nghi ngờ và phải xét nghiệm lại hoặc dùng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng định.