Mẫu thử sử dụng cho phương pháp kiểm tra bệnh vi bào tử bằng phương pháp nhuộm HE được quy định như thế nào?

Nội dung chính

• Mẫu thử sử dụng cho phương pháp kiểm tra bệnh vi bào tử bằng phương pháp nhuộm HE được quy định như thế nào?
• Quy trình tiến hành phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm ra sao?
• Mẫu chẩn đoán cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE cho kết quả dương tính khi nào?

Mẫu thử sử dụng cho phương pháp kiểm tra bệnh vi bào tử bằng phương pháp nhuộm HE được quy định như thế nào?

Theo tiết 6.3.1 và tiết 6.3.2 tiểu mục 6.3 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về lấy mẫu và bảo quản mẫu bệnh dùng trong phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.3 Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

6.3.1 Lấy mẫu

Tôm ấu trùng, hậu ấu trùng sử dụng nguyên con. Tôm bố mẹ, tôm thương phẩm lấy nguyên con hoặc bộ phận đầu ngực có chứa khối gan tụy (< 1 cm3). Cố định mẫu trong dung dịch Davidson (3.3.3) ngay sau khi lấy mẫu với tỷ lệ mẫu và dung dịch Davidson là 1: 10.

6.3.2 Bảo quản mẫu

Mẫu cố định trong Davidson (3.3.3) chuyển đến phòng thí nghiệm trong khoảng từ 24 h đến 72 h sau khi lấy mẫu

..."

Theo đó, mẫu bệnh là tôm ấu trùng, hậu ấu trùng thì sử dụng nguyên con, nếu là tôm bố mẹ, tôm thương phẩm thì lấy nguyên con hoặc bộ phận đầu ngực có chứa khối gan tụy

Cố định mẫu trong dung dịch Davidson ngay sau khi lấy mẫu với tỷ lệ mẫu và dung dịch Davidson là 1: 10, chuyển đến phòng thí nghiệm trong khoảng từ 24 h đến 72 h sau khi lấy mẫu

Đối với phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE thì việc bảo quản mẫu không có quy định về nhiệt độ.

Mẫu thử sử dụng cho phương pháp kiểm tra bệnh vi bào tử bằng phương pháp nhuộm HE được quy định như thế nào? (Hình từ Internet)

Quy trình tiến hành phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm ra sao?

Theo Phục lục E Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về tiến hành phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE như sau:

"E.1 Xử lý mẫu

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm etanol 70 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 95 % (3.1.1) trong thời gian 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ nhất trong thời gian từ 60 đến 90 min.

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ hai trong thời gian từ 60 đến 90 min.

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ nhất trong thời gian 90 min.

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ hai, thời gian từ 120 min.

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2).

Đúc khuôn

Đưa mẫu vào khung đúc parafin: Rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4) chuyên dụng.

Gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên.

Để nguội, tách lấy khối parafin.

E.2 Cắt tiêu bản

Cắt gọt khối parafin cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.2.5).

Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức.

Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C.

Dùng lam kính (4.2.8) vớt những lát cắt bằng phẳng, chuyển sang máy sấy ở 40°c trong 2 đến 3 h.

E.3 Nhuộm tiêu bản

Tẩy parafin trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 100 % (3.1.1) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 95 % (3.1.1) để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 70 % (3.1.1) để từ 3 đến 5 min.

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm Haematoxylin (3.3.4) từ 3 đến 5 min.

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm từ Eosin (3.3.5) từ 3 đến 5 min.

Nhúng qua etanol 70 % (3.1.1) để từ 2 đến 3 min; sau đó nhúng qua etanol 100 % (3.1.1) 3 lần (3 cốc), mỗi lần để từ 2 đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần từ 2 đến 3 min; lau sạch xung quanh và gắn lamen (4.2.9) bằng keo dán.

Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.10)."

Như vậy, quy trình tiến hành phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên

Các bước cần thực hiện của phương pháp gồm 03 bước: xử lý mẫu - cắt tiêu bản - Nhuộm tiêu bản

Mẫu chẩn đoán cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE cho kết quả dương tính khi nào?

Theo tiết 6.3.5 tiểu mục 6.3 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về đọc kết quả sau khi tiến hành phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.3 Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

...

6.3.5 Đọc kết quả

Mẫu dương tính khi thấy trong nguyên sinh chất của tế bào biểu mô ống gan thận có các thể vùi bắt mầu kiềm (basophilic) chứa các đám bào tử hình trứng hay ellip kích thước 1,1 ± 0,2 x 0,6 ± 0,1 µm.

Các bào tử EHP có thể phát hiện trong ống gan tụy ở trạng thái tự do."

Nếu trong nguyên sinh chất của tế bào biểu mô ống gan thận có các thể vùi bắt mầu kiềm (basophilic) chứa các đám bào tử hình trứng hay ellip kích thước 1,1 ± 0,2 x 0,6 ± 0,1 µm thì mẫu thử có kết quả dương tính.