Môi trường thạch BA được sử dụng trong phương pháp nào để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá?

Nội dung chính

• Môi trường thạch BA có thành phần cấu tạo như thế nào? Cách điều chế ra sao?
• Môi trường thạch BA được sử dụng trong phương pháp nào để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá?
• Công dụng của môi trường thạch BA là gì trong việc chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá bằng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn?

Môi trường thạch BA có thành phần cấu tạo như thế nào? Cách điều chế ra sao?

Theo Phụ lục A Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử như sau:

A.1 Môi trường thạch BA (thạch máu)

Thành phần:

Special nutrient substrate 23,0 g

Starch 1,0 g

Sodium chloride 5,0 g

Agar 13,0 g

Nước cất vô trùng 1000 ml

Máu ngựa hoặc cừu vô trùng 5 %

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần (trừ máu ngựa hoặc cừu) với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C. Cho 5ml máu cừu hoặc máu ngựa vào 95 ml môi trường, trộn đều và đổ đĩa.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng thạch BA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2 Môi trường thạch chọn lọc Chromagar Strep B

Thành phần:

Peptone và yeast extract 20,0 g

Muối 7,5 g

Hỗn hợp Chromogenic 2,2 g

Thạch 15,0 g

Nước cất vô trùng 1010 ml

Chất bổ sung (supplement) S1 8 ml

Chất bổ sung (supplement) S2 0,25 g

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần (trừ chất bổ sung) với 1000 ml nước cất trong chai tam giác vô trùng. Thêm 8ml chất bổ sung S1 vào dung dịch huyền phù trên. Khuấy đều cho đến khi thạch tan hết. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C.

Hòa tan 0,25 g chất bổ sung S2 vào 10 ml nước cất.

Dùng lọc tiệt trùng và cho 10 ml chất bổ sung S2 vào môi trường đã làm nguội 45 °C đến 50 °C. Lắc hoặc khuấy nhẹ để đồng nhất môi trường, đổ vào đĩa petri vô trùng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng thạch Chromagar Strep B thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.3 Môi trường thạch dinh dưỡng TSA

Thành phần:

Peptone từ casein 15,0 g

Peptone từ đậu nành 5,0 g

NaCl 5,0 g

Thạch 15,0 g

Nước cất vô trùng 1000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C, trộn đều và đổ đĩa.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TSA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.4 Môi trường canh BHI

Thành phần:

Chất dinh dưỡng (chiết xuất từ não, tim và peptone) 27,5 g

Glucose 2,0 g

NaCl 5,0 g

Disodium phosphate 2,5 g

Nước cất vô trùng 1000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Điều chỉnh pH 7,4 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường BHI thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.5 Môi trường kiểm tra tính chất sinh hóa

Sử dụng card định danh vi khuẩn gram dương hoặc kít kiểm tra sinh hóa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Theo đó, môi trường thạch BA được cấu tạo từ những thành phần sau:

- Special nutrient substrate 23,0 g

- Starch 1,0 g

- Sodium chloride 5,0 g

- Agar 13,0 g

- Nước cất vô trùng 1000 ml

- Máu ngựa hoặc cừu vô trùng 5 %

Hòa tan các thành phần (trừ máu ngựa hoặc cừu) với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C. Cho 5ml máu cừu hoặc máu ngựa vào 95 ml môi trường, trộn đều và đổ đĩa.

Có thể sử dụng thạch BA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Môi trường thạch BA (Hình từ Internet)

Môi trường thạch BA được sử dụng trong phương pháp nào để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về thuốc thử và vật liệu thử như sau:

Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết, phân tích, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, không có DNase/RNase, trừ khi có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử của phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn (xem phụ lục A)

3.1.1 Môi trường thạch BA (thạch máu) gồm thạch Colombia và 5 % máu cừu;

3.1.2 Môi trường thạch chọn lọc Chromagar Strep B;

3.1.3 Môi trường thạch dinh dưỡng TSA;

3.1.4 Môi trường canh thang BHI;

3.1.5 Card định danh vi khuẩn Gram (+) hoặc kit kiểm tra sinh hóa;

3.1.6 Thuốc nhuộm gram (Xem phụ lục B).

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử của phương pháp Realtime PCR

3.2.1 Dung dịch tách chiết (NaCl 0,9%...) hoặc bộ kit tách chiết ADN vi khuẩn;

3.2.2 Bộ kit nhân gen: Power SYBR Green PCR Master Mix;

3.2.3 Đoạn mồi (primers);

3.2.4 Mẫu đối chứng;

3.2.5 Nước không có enzyme phân hủy ADN/ARN;

3.2.6 Thang chuẩn ADN 100bp;

3.2.7 Dung dịch đệm TBE 10X;

3.2.8 Bột Agarose;

3.2.9 Chất nhuộm màu (GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

3.2.10 Chất đệm tải mẫu (Loading dye);

3.2.11 Cồn (Ethanol) 70 % (C2H6O).

Như vậy, môi trường thạch BA được dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá.

Công dụng của môi trường thạch BA là gì trong việc chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá bằng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn?

Theo tiết 6.2.2.1 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về phân lập vi khuẩn như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.2 Phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae

6.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

6.2.1.1 Phân lập vi khuẩn

Đối với cá nhỏ (chiều dài nhỏ hơn 10 cm): Đồng nhất các cơ quan nội tạng, dùng que cấy, cấy ria lên môi trường thạch BA hoặc trên môi trường chọn lọc Chromagar Strep B.

Đối với cá lớn (chiều dài trên 10 cm): Sau khi mổ khám, dùng cồn 70 % (xem 3.2.11) sát trùng bề mặt các cơ quan nội tạng, dùng que cấy, cấy ria từ các cơ quan nội tạng như gan, thận, lách hoặc từ não cá trên môi trường thạch BA hoặc trên môi trường chọn lọc Chromagar Strep B.

Sau khi cấy, ủ đĩa thạch trong tủ ấm (xem 4.1.3) ở 28 °C đến 30 °C sau 24 giờ đến 48 giờ. Trên môi trường thạch BA, khuẩn lạc hình tròn, trơn nhẵn, đường kính từ 1,5 mm đến 2 mm, sắc tố màu trắng và dung huyết dạng β và trên môi trường Chromagar Strep B có dạng hình tròn và màu tím hoa cà điển hình được nghi ngờ là vi khuẩn Streptococcus agalactiae.

Dùng que cấy vô trùng, chọn khuẩn lạc điển hình cấy ria trên môi trường thạch TSA (xem 3.1.3) ủ thạch trong tủ ấm (xem 4.1.3) ở 28 °C đến 30 °C trong 24 giờ đến 48 giờ. Lấy khuẩn lạc thuần kiểm tra sinh hóa, đồng thời tăng sinh khuẩn lạc trong 2 ml canh thang BHI (xem 3.1.4) để tiến hành nhuộm Gram vì Streptococcus agalactiae chỉ xuất hiện dạng chuỗi khi chúng được nuôi trong môi trường canh hoặc trong mô động vật.

CHÚ THÍCH: Vi khuẩn Streptococcus agalactiae có thể nuôi cấy trên môi trường thạch BHI, thạch TSA, canh BHI, canh TSA,... vì thế tùy điều kiện phòng thí nghiệm để lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp

Theo tiêu chuẩn trên thì môi trường thạch BA dùng để lấy khuẩn lạc từ mẩu bệnh phẩm dùng cho việc xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên mẫu bệnh phẩm có phải là vi khuẩn Streptococcus Agalactiae hay không.