Muốn thực hiện phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể bệnh Gumboro ở gà thì cần dùng mẫu bệnh phẩm nào để chẩn đoán?

Nội dung chính

• Muốn thực hiện phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể bệnh Gumboro ở gà thì cần dùng mẫu bệnh phẩm nào để chẩn đoán?
• Việc chuẩn bị mẫu khi tiến hành phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh Gumboro ở gà được thực hiện ra sao?
• Phương pháp ELISA được tiến hành theo trình tự như thế nào?

Muốn thực hiện phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể bệnh Gumboro ở gà thì cần dùng mẫu bệnh phẩm nào để chẩn đoán?

Theo tiết 6.3.1 và tiết 6.3.2 tiểu mục 6.3 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm quy định về mẫu bệnh phẩm dùng trong phương pháp ELISA như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Gumboro

...

6.3.1. Lấy mẫu

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu tĩnh mạch cánh hoặc máu tim của gà nghi mắc bệnh nhưng chưa tiêm phòng vắc xin. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.3.2. Bảo quản mẫu

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1).

...

Theo tiêu chuẩn trên thì mẫu bệnh phẩm dùng trong phương pháp ELISA là máu tĩnh mạch cánh hoặc máu tim của gà nghi mắc bệnh nhưng chưa tiêm phòng vắc xin.

Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh âm sâu.

Bệnh Gumboro ở gà (Hình từ Internet)

Việc chuẩn bị mẫu khi tiến hành phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh Gumboro ở gà được thực hiện ra sao?

Theo tiết 6.3.3 tiểu mục 6.3 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm thì mẫu huyết thành (mẫu bệnh phẩm) thu được cần được chắt sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

Phương pháp ELISA được tiến hành theo trình tự như thế nào?

Theo tiết 6.3.4 tiểu mục 6.3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm quy định về cách tiến hành phương pháp ELISA như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Gumboro

...

6.3.4. Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Gumboro (Infectious Brusal disease test kit) của hãng IDEXX3)

6.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu

- Các nguyên liệu của bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, trước khi tiến hành phản ứng phải được đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 °C đến 26 °C);

- Mẫu huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/500 với dung dịch pha loãng mẫu (Lấy 1 ml huyết thanh pha với 500 ml dung dịch pha loãng mẫu);

- Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 10 lần (Wash Concentrate 10 X): lấy 1 phần nước rửa đậm đặc pha với 9 phần nước cất;

- Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 ml/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng;

- Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control - NC), kiểm chứng dương (Positive Control - PC).

6.3.4.2. Tiến hành phản ứng

Bước 1: Nhỏ huyết thanh

- Nhỏ 100 ml dung dịch pha loãng mẫu vào giếng có mẫu trắng (Blank);

- Nhỏ 100 ml kiểm chứng âm không pha loãng vào hai giếng đối chứng âm;

- Nhỏ 100 ml kiểm chứng dương không pha loãng vào hai giếng đối chứng dương;

- Nhỏ 100 ml huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng vào các giếng thích hợp;

- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

- Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.

Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể (conjugate)

- Nhỏ 100 ml dung dịch kháng kháng thể vào các giếng;

- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

- Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.

Bước 3: Nhỏ cơ chất

- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất TMB vào các giếng;

- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 15 min.

Bước 4: Dừng phản ứng

- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào các giếng;

Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm.

6.3.5. Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Giá trị OD của đối chứng dương trừ giá trị OD của đối chứng âm phải lớn hơn 0,075;

- Giá trị OD của đối chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15.

Tính kết quả:

- Trung bình của đối chứng âm: [NC1 A (650) + NC2 A(650)] / 2 = NC x tb

- Trung bình của đối chứng dương: [PC1 A (650) + PC2 A (650)] / 2 = PC x tb

- Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu - NC x tb) / (PCx tb - NC x tb)

- Hiệu giá của mẫu: log10 Titer = 1,09 (log10 S/P) + 3,36

CHÚ THÍCH: S/P là tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của mẫu bệnh phẩm so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng dương.

Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:

- Mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể Gumboro có S/P lớn hơn hoặc bằng 0,20;

- Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Gumboro có S/P nhỏ hơn 0,20.

Theo đó, phương pháp ELISA được thực hiện theo trình tự nêu trên để phát hiện kháng thể bệnh Gumboro ở gà.