Nguyên liệu dùng cho phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phù đầu gà gồm những gì? Chuẩn bị ra sao?

Nội dung chính

• Để chẩn đoán bệnh phù đầu gà bằng phương pháp PCR thì cần sử dụng cặp mồi nào?
• Nguyên liệu dùng cho phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phù đầu gà gồm những gì? Chuẩn bị ra sao?
• Phương pháp PCR dùng để chẩn đoán bệnh phù đầu gà được thực hiện như thế nào?
• Kết quả tiến hành phương pháp PCR cho kết quả dương tính với bệnh phù đầu gà khi nào?

Để chẩn đoán bệnh phù đầu gà bằng phương pháp PCR thì cần sử dụng cặp mồi nào?

Theo tiết 5.2.3.3 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) quy định về cặp mội sử dụng trong phương PCR như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.3.3. Xác định vi khuẩn bằng phương pháp PCR

Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 2

Tiến hành phản ứng PCR theo Phụ lục C.

...

Theo đó, để chẩn đoán bệnh phù đầu gà bằng phương pháp PCR thì có thể sử dụng các cặp mồi đặc hiệu như cặp mồi N1 và R1 theo tiêu chuẩn nêu trên.

Nguyên liệu dùng cho phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phù đầu gà gồm những gì? Chuẩn bị ra sao?

Theo điểm C.1 và điểm C.2 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) quy định về nguyên liệu dùng cho phương pháp PCR như sau:

Phụ lục C

(Qui định)

Phát hiện vi khuẩn Avibacterium paragallinarum bằng phương pháp PCR

C.1. Nguyên liệu PCR

C.1.1. Taq PCR Master Mix Kit

C.1.2. Cặp mồi (primers); mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2).

C.1.3. Nước tinh khiết không có nuclease

C.1.4. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

C.1.5. Chất nhuộm màu Ethidi bromua hoặc SYBR green

C.1.6. Loading dye

C.1.7. DNA chuẩn (Ladder, marker)

C.2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là Avibacterium paragallinarum đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu (xem 3.1) có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus hay thạch sô-cô-la (xem 3.2) được để ở tủ ấm (xem 4.1) trong 24 h.

Đối chứng dương: Chủng vi khuẩn đã được giám định là Avibacterium paragallinarum hoặc sử dụng các chủng Avibacterium paragallinarum chuẩn.

...

Theo đó, để sử dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phù đầu gà thì cần sử dụng một số nguyên liệu sau:

- Taq PCR Master Mix Kit

- Cặp mồi (primers); mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2).

- Nước tinh khiết không có nuclease

- Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

- Chất nhuộm màu Ethidi bromua hoặc SYBR green

-. Loading dye

- DNA chuẩn (Ladder, marker)

Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là Avibacterium paragallinarum đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus hay thạch sô-cô-la được để ở tủ ấm trong 24 h.

Nguyên liệu dùng cho phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh phù đầu gà gồm những gì? (Hình từ Intetnet)

Phương pháp PCR dùng để chẩn đoán bệnh phù đầu gà được thực hiện như thế nào?

Theo điểm C.3, C.4 và điểm C.5 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) quy định về các bước tiến hành phương pháp PCR như sau:

- Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kít thương mại hay bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

- Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 ml nước. Đun huyễn dịch trong máy ổn nhiệt khô trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá lạnh trong 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nước trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

- Sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 2, chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 mM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:

Taq PCR Master Mix Kit: 12,5 ml

Mồi xuôi 20 mM: 1 ml

Mồi ngược 20 mM: 1 ml

Nước không có nuclease: 8,5 ml

Mẫu DNA: 2 ml

Tổng thể tích: 25 ml

- Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

- Cho 2 ml dung dịch loading dye vào 8 ml sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 ml thang chuẩn (marker) vào một giếng.

- Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml.

- Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).

Kết quả tiến hành phương pháp PCR cho kết quả dương tính với bệnh phù đầu gà khi nào?

Theo điểm C.6 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) quy định về kết quả phương pháp PCR như sau:

Phụ lục C

(Qui định)

Phát hiện vi khuẩn Avibacterium paragallinarum bằng phương pháp PCR

...

C.6. Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính khi:

+ Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

+ Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch;

+ Mẫu kiểm tra: Có vạch giống mẫu đối chứng dương.

- Phản ứng âm tính khi:

+ Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

+ Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch;

+ Mẫu kiểm tra: Không xuất hiện vạch;

Như vậy trường hợp phương pháp PCR cho kết quả dương tính với bệnh phù đầu gà khi :

- Mẫu đối chứng dương tính cho kết quả dương tính khi có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

- Mẫu đối chứng âm tính cho kết quả dương tính khi có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.