Phản ứng Nested RT PCR trong phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá có bao nhiêu bước thực hiện?

Nội dung chính

• Cặp mồi sử dụng trong phương pháp Nested RT PCR nhằm phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm những cặp mồi nào?
• Phản ứng Nested RT PCR trong phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá có bao nhiêu bước thực hiện?
• Quá trình điện di trong phương pháp Nested RT PCR xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá được thực hiện ra sao?

Cặp mồi sử dụng trong phương pháp Nested RT PCR nhằm phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm những cặp mồi nào?

Bệnh hoại tử thần kinh (Hình từ Internet)

Theo mục C.1 Phục lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về cặp mồi sử dụng trong phương pháp Nested RT PCR như sau:

C.1 Trình tự cặp mồi

Từ tiêu chuẩn trên thì cặp mồi sử dụng trong phương pháp Nested RT PCR nhằm phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm:

- F2: 5'-CGT-GTC-AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3', kích thước 420 bp

- R3: 5'-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3, kích thước 420 bp

- F'2: 5'-GTT-CCC-TGT-ACA-ACG-ATT-CC-3', kích thước 294 bp

- R'3: 5'-GGA-TTT-GAC-GGG-GCT-GCT-CA-3', kích thước 294 bp

Phản ứng Nested RT PCR trong phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá có bao nhiêu bước thực hiện?

Theo mục C.2 Phục lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về các bước thực hiện phản ứng Nested RT PCR như sau:

C.2 Thực hiện phản ứng Nested RT - PCR

Kỹ thuật nested RT- PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước):

Giai đoạn 1 (bước 1): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi F2/R3 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng C.2).

VÍ DỤ: Kit nhân gen SuperScript" III One-Step RT-PCR with Platinum" Taq. Cat: 12574-0263)

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng VNN chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 2,5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Sau đó, lấy sản phẩm bước 1 ra để chuẩn bị cho phản ứng bước 2 - Nested RT - PCR

Giai đoạn 2 (bước 2): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi F’2/R’3 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) Cat K0171)4)

Thành phần cho 1 phản ứng bước 2 (xem Bảng C.4).

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 3 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới.

Mẫu đối chứng âm: Cho 3 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới.

Mẫu thử: Cho 3 µl mẫu sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

Tiến hành phản ứng Nested RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.5).

Sau khi kết thúc chu trình nhiệt của phản ứng Nested RT - PCR tiến hành điện di theo mục (6.1.3.4)

Theo tiêu chuẩn nêu trên thì phản ứng Nested RT PCR trong phương pháp Nested RT PCR được tiến hành theo 02 giai đoạn,

Các thành phần có phản ứng Nester RT PCR bao gồm:

- Nước không có ARN/DNA;

- Dung dịch 2x Reaction Mix

- Mồi F2;

- Mồi R3;

- Enzyme Tag Mix;

- Mồi F’2;

- Mồi R’3.

Sau khi kết thúc chu trình nhiệt của phản ứng Nested RT - PCR tiến hành điện di để xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh có xuất hiện trong cá hay không.

Quá trình điện di trong phương pháp Nested RT PCR xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá được thực hiện ra sao?

Theo tiết 6.1.3.4 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về quá trình điện di trong phương pháp Nested RT PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp Nested RT - PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

...

6.1.3.4 Điện di

6.1.3.4.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.10) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.11) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.12) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe DNA gel stain2) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.3.4.2 Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.13) vào 8 µl sản phẩm Nested RT - PCR (bước 2) trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.6), chạy kèm theo thang chuẩn DNA (Ladder) (3.2.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn DNA (Ladder) (3.2.7) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

Như vậy, để thực hiện điện di thì cần chuẩn bị bảng gel để sử dụng cho quá trình thực hiện.

Sau khi đã có bản gel thì hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) vào 8 µl sản phẩm Nested RT - PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.Thực hiện điện di trong bộ điện di, chạy kèm theo thang chuẩn DNA (Ladder) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn DNA (Ladder) vào một giếng trên bản thạch. Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.