Phản ứng PCR trong phương pháp RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh còi ở tôm có bao nhiêu bước phản ứng?

Nội dung chính

• Cần sử dụng những cặp mồi nào trong phản ứng PCR khi thực hiện phương pháp RT PCR chẩn đoán bệnh ở tôm?
• Phản ứng PCR trong phương pháp RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh còi ở tôm có bao nhiêu bước phản ứng?
• Các bước phản ứng PCR trong phương pháp RT PCR được thực hiện như thế nào?

Phản ứng PCR trong phương pháp RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh còi ở tôm có bao nhiêu bước phản ứng? (Hình từ Internet)

Cần sử dụng những cặp mồi nào trong phản ứng PCR khi thực hiện phương pháp RT PCR chẩn đoán bệnh ở tôm?

Theo tiết 3.2.1.5.2.1 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về cặp nồi sử dụng trong quá trình phản ứng PCR như sau:

"3.2.1.5.2.1 Cặp mồi ngoài sử dụng trong phản ứng PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt theo phương pháp PCR tổ (nested PCR) khuếch đại ADN đặc hiệu của vi rút MBV, sử dụng cặp mồi MBV1.4 F/R và MBV1.4 NF/NR (Bảng 1).

Cặp mồi MBV 1.4 F/R dùng để khuếch đại đoạn ADN của vi rút MBV có kích thước 533 bp. Cặp mồi MBV 1.4NF /NR dùng để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 361 bp, nằm trong đoạn ADN sản phẩm bước 1 của vi rút MBV.

Chuẩn bị mồi:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µL làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µL: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước)."

Theo đó, cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR gồm cặp mồi MBV1.4 F/R và MBV1.4 NF/NR. Trình tự cặp mồi được thực hiện theo thứ tự tại bảng 1 nêu trên.

Tác dụng của việc sử dụng cặp mồi là để khuếch đại đoạn ADN của vi rút MBV nhằm tiến hành các bước chẩn đoán bệnh còi ở tôm.

Phản ứng PCR trong phương pháp RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh còi ở tôm có bao nhiêu bước phản ứng?

Theo tiết 3.2.1.5.2.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về bước chuẩn bị phản ứng PCR như sau:

"3.2.1.5.2.2 Chuẩn bị phản ứng

Tùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hỗn hợp phản ứng bước 1 và bước 2 được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm. Sau đó hút 22,5 µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, chứng dương và chứng âm."

Như vậy, theo quy định thì cần chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bước 1 và bước 2 nên có thể biết được phản ứng PCR sẽ gồm 02 bước phản ứng.

Các bước phản ứng PCR trong phương pháp RT PCR được thực hiện như thế nào?

Theo tiết 3.2.1.5.2.3 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về tiến hành phản ứng PCR như sau:

3.2.1.5.2.3 Tiến hành phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1).

Thêm 2,5 µl ADN mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứngPCR (thành phần gồm: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP có nồng độ0,2 mM; MgCl2 1,5 mM; mỗi mồi MBV1.4F và MBV1.4R có nồng độ 0,25 µM; 1,25 U Taq ADNpolymerase và nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

Có thể sử dụng thành phần thuốc thử riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như trên, ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); 400 µM dATP; 400 µM dGTP; 400 µM dTTP; 400 µM dCTP; 3 mM MgCl2; Taq ADN polymerase, và chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).

Hỗn hợp phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1), sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mixcủa Promega, 2X như trong Bảng 2.

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.

Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR bước 1 được nêu trong Bảng 3.

3.2.1.5.2.4 Tiến hành phản ứng PCR vòng trong (bước 2)

Thêm 2,5 µl ADN mạch khuôn (sản phẩm bước 1) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP có nồng độ0,2 mM; MgCl2 1,5 mM; mỗi mồi MBV1.4F và MBV1.4R có nồng độ 0,25 µM; 1,25 U Taq ADNpolymerase và nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

Có thể sử dụng thành phần hoá chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như trên, sử dụng cặp mồi MBV1.4NF và MBV1.4NR.

Hỗn hợp phản ứng PCR bước 2, sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 4.

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt. Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR

bước 2 được nêu trong Bảng 5.

CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng."

Theo đó, phản ứng PCR thực hiện theo hai bước bao gồm bước 1 là phản ứng vòng ngoài và bước 2 là phản ứng vòng trong. Mỗi bước phản ứng sẽ cần chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và chu kì luân nhiệt riêng biệt được quy định theo Tiêu chuẩn nêu trên.