Phản ứng RT PCR khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm có mấy bước phản ứng?

Nội dung chính

• Tôm mắc bệnh hoại tử cơ sẽ có những triệu chứng bệnh như thế nào?
• Thành phần tạo nên dung dịch thuốc thử khi thực hiện phản ứng RT PCR trong phương pháp RT PCR gồm những thành phần nào?
• Phản ứng RT PCR khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm có mấy bước phản ứng?

Tôm mắc bệnh hoại tử cơ sẽ có những triệu chứng bệnh như thế nào?

Theo tiết 3.1.2 tiểu mục 3.1 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về triệu chứng lâm sàng khi tôm mắc bệnh hoại tử cơ như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

3.1. Chẩn đoán lâm sàng

...

3.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn cấp tính của bệnh IMNV: cơ vân tôm vùng bụng kéo dọc đến phần đuôi bị hoại tử, có màu trắng đục. Tôm bơi lờ đờ, dạt bờ rồi chết. Tôm chết nhiều liên tiếp trong vài ngày, tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 40 % đến 70 % trong ao nhiễm.

CHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp, tôm bị stress do yếu tố môi trường hoặc tôm bị bệnh trắng đuôi cũng thể hiện dấu hiệu bệnh lý tương tự."

Tôm mắc bệnh hoại tử cơ thì sẽ có triệu chứng như cơ vân tôm vùng bụng kéo dọc đến phần đuôi bị hoại tử, có màu trắng đục. Tôm bơi lờ đờ, dạt bờ rồi chết. Tôm chết nhiều liên tiếp trong vài ngày, tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 40% - 70% trong ao nhiễm.

Phản ứng RT PCR khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm có mấy bước phản ứng? (Hình từ Internet)

Thành phần tạo nên dung dịch thuốc thử khi thực hiện phản ứng RT PCR trong phương pháp RT PCR gồm những thành phần nào?

Theo Phụ lục A TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử như sau:

"A.1. Dung dịch Davidson

Etanol 95 % 330 ml

Formalin (formaldehyd 37 %) 220 ml

Axit axetic đậm đặc 115 ml

Nước 335 ml

A.2. Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể 1 g

Natri iodat 0,2 g

Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g

Axit axetic 1 g

Cloral hydrat 50 g

Nước 1000 ml

Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hòa tan, tiếp tục cho axit axetic và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3. Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y 1 g

Etanol 70 % 1 lít

Axit axetic băng 5 ml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa tan eosin trong etanol, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4. Dung dịch R-F (RNA - friendly)

Formaldehyd 37 % 349 ml

Cồn 95 % 407 ml

Nước 244 ml

Chỉnh pH = 7."

Như vậy, để tạo nên dung dịch thuốc thử để thực hiện phản ứng RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm cần dùng những thành phần được quy định nêu trên.

Phản ứng RT PCR khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm có mấy bước phản ứng?

Theo tiết 3.2.1.5.2.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về phản ứng RT PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng

Tùy theo điều kiện phòng thí nghiệm chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng thương mại phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước một và bước hai theo số mẫu chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm, trộn chung vào một ống Eppendorf.

Sau đó hút 22,5 l hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml, ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

3.2.1.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR bước 1

Thêm 2,5 l RNA mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 l hỗn hợp phản ứng RT-PCR (thành phần gồm: dung dịch đệm 1X EZ; mỗi loại dNTP có nồng độ 300 M; mồi 4587F, 4914R có nồng độ 0,465 M; Mn(OCOCH3)2 2,5 mM và nước cho đủ thể tích để được hỗn hợp với tổng thể tích 25 l.

Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1, xem Bảng 2.

Bảng 2 - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.

Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 1 được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 1

Sản phẩm khuếch đại bảo quản ở 4 oC cho đến khi điện di.

3.2.1.5.2.4. Tiến hành phản ứng RT-PCR bước 2

Thêm 0,5 l RNA mạch khuôn (sản phẩm PCR bước 1) vào ống PCR chứa sẵn 24,5 l hỗn hợp phản ứng RT-PCR (thành phần gồm: mỗi dNTP có nồng độ 200 M; magie clorua 1,5 mM và 2,5 U của Taq DNA polymerase, mỗi mồi 4725 NF, 4863 NR có nồng độ 0,465 M và nước cho đủ thể tích để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 l.

Có thể sử dụng thành phần hóa chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần trên.

Ví dụ về sử dụng hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 2, sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega 2 X, xem bảng 4.

Bảng 4 - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 2

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng, đặt hỗn hợp vào máy luân nhiệt. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bước 2 được nêu trong Bảng 5.

Bảng 5 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 2

CHÚ Ý: Mẫu, nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

CẢNH BÁO: Do bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong môi trường cũng như enzym RNAase tiết ra từ các vi sinh vật, môi trường chai, lọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzym RNAase rất bền, khó bị phân hủy bởi nhiệt độ. Vì vậy, tất cả mọi dụng cụ, thiết bị, thuốc thử dùng trong RT-PCR phải tuyệt đối vô trùng."

Như vậy, phản ứng RT PCR có 02 bước phản ứng. Khi thực hiện phản ứng RT PCR phải đảm bảo thành phần dung dịch và nhiệt độ khi thực hiện chu trình phản ứng nhiệt theo đúng quy định nêu trên.