Phát hiện bệnh dịch tả ở vịt qua các triệu chứng lâm sàng thế nào? Quy trình chẩn đoán được thực hiện ra sao?

Nội dung chính

• Phát hiện bệnh dịch tả ở vịt qua các triệu chứng lâm sàng thế nào?
• Quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt được thực hiện gồm mấy bước?
• Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt thế nào?
• Phát hiện kháng nguyên trong việc chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt thế nào?
• Phát hiện kháng thể trong việc chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt thế nào?
• Kết luận kết quả chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt tại phòng thí nghiệm thế nào?

Phát hiện bệnh dịch tả ở vịt qua các triệu chứng lâm sàng thế nào?

Căn cứ vào tiểu mục 6.1 và tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-11:2019 thì:

- Bệnh dịch tả vịt lây lan cho vịt, ngan, ngỗng ở mọi lứa tuổi, từ 7 ngày tuổi đến khi trưởng thành. Ở những đàn nhạy cảm, bệnh lây lan nhanh và trầm trọng với dấu hiệu tử vong cao, đột ngột (xảy ra từ 1 ngày đến 5 ngày sau khi bắt đầu có triệu chứng lâm sàng) và dai dẳng, sụt giảm đáng kể trứng trong những đàn lấy trứng.

- Tỷ lệ chết có thể từ 70 % đến 80 % nếu bị nhiễm lần đầu ở trại không tiêm phòng vắc xin dịch tả vịt thường xuyên, kết hợp với vệ sinh không đảm bảo. Các triệu chứng lâm sàng gồm có:

+ Thời gian ủ bệnh thường từ 3 ngày đến 7 ngày tùy theo độc lực của vi rút.

+ Triệu chứng đặc trưng là sốt cao, sưng phù đầu, mù mắt, tiêu chảy phân trắng xanh, biểu hiện thần kinh quẹo đầu.

+ Vịt, ngan, ngỗng bị bệnh có hiện tượng giảm ăn, mất thăng bằng, phân loãng, xù lông, chảy nước mũi, mắt có dử, mí mắt sưng. Con vật sợ ánh sáng.

- Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp giữa các vịt khỏe mạnh và vịt bị nhiễm bệnh. Bệnh truyền qua phân thủy cầm mắc bệnh và các dịch tiết từ mũi, miệng và mắt.

- Bệnh lây lan nhanh và có thể lây lan dễ dàng bằng phương tiện cơ học như giày dép và quần áo mang từ một đàn bị nhiễm đến.

Phát hiện bệnh dịch tả ở vịt qua các triệu chứng lâm sàng thế nào? Quy trình chẩn đoán được thực hiện ra sao?

Quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt được thực hiện gồm mấy bước?

Tại Mục 7 và Mục 8 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-11:2019 thì chẩn đoán dịch tả tại phòng thí nghiệm gồm 4 bước như sau:

- Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

- Phát hiện kháng nguyên

- Phát hiện kháng thể với hai phương pháp:

+ Phương pháp trung hòa huyết thanh trên phôi trứng vịt

+ Phương pháp trung hòa huyết thanh trên tế bào xơ phôi vịt

- Kết luận.

Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt thế nào?

- Việc lấy mẫu thực hiện theo tiết 7.1.1 tiểu mục 7.1 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-11: 2019 như sau:

Bước 1: Lấy mẫu theo hướng dẫn của quy trình mổ khám TCVN 8402:2010.

Bước 2: Mẫu được lấy vào thời kỳ đầu của ổ dịch, mẫu lấy ngay sau khi con vật ốm, chết hoặc mổ khám.

Mẫu bệnh phẩm là gan, lách, thận. Nếu là con vật bệnh hoặc xác mới chết phải lấy từ 3 con đến 5 con. Bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt, huyết thanh được lấy sau 10 ngày từ khi dịch bệnh xảy ra, hoặc nếu vịt đã tiêm phòng thì lấy sau khi tiêm 1 tháng để kiểm tra kháng thể bảo hộ.

Bước 3: Bảo quản và vận chuyển mẫu

Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C.

Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ âm 20 °C (đối với mẫu huyết thanh) và ở âm 80 °C (đối với mẫu bệnh phẩm phát hiện vi rút).

- Xử lý mẫu bệnh thực hiện theo Tiết 7.1.2 Tiểu Mục 7.1 Muc 7 TCVN 8400-11:2019 như sau:

+ Tạo huyễn dịch 10% từ mẫu bệnh phẩm (gan, lách, thận) trong dung dịch PBS (4.1.2) vô trùng (ví dụ: nghiền 1 g mẫu bệnh phẩm trong 9 ml dung dịch PBS).

+ Sau đó ly tâm huyễn dịch 2500 g trong 15 phút bằng máy ly tâm (5.2.3). Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện vi rút dịch tả vịt bằng phản ứng realtime PCR, PCR hoặc phân lập vi rút.

+ Bệnh phẩm là máu được giữ ở 4 °C đến 8 °C chờ đông rồi tách lấy huyết thanh để chẩn đoán phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt.

Phát hiện kháng nguyên trong việc chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt thế nào?

Việc phát hiện kháng nguyên thực hiện theo Tiểu mục 7.2 Muc 7 TCVN 8400-11:2019 như sau:

Bước 1: Phân lập và giám định vi rút dịch tả vịt

- Trên phôi trứng vịt

Sử dụng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi để tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý (7.1.2). Thu hoạch dịch niệu mô để giám định vi rút bằng phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn trên phôi trứng vịt (xem Phụ lục B) hoặc bằng phương pháp realtime PCR hoặc PCR (7.2.3), cụ thể như sau:

"7.2.3.2 Phương pháp realtime PCR

- Sử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò (tham khảo Bảng E.1, Phụ lục E) với nồng độ thích hợp (mồi ở nồng độ 20 µM, đoạn dò ở nồng độ 5 µM) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG 2), Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi thành phần Master mix cho phù hợp với tên trong Bảng E.2, Phụ lục E).

- Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng (tham khảo Bảng E.2, Phụ lục E).

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút DVE có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương.

+ Cho 5 µl nước tinh khiết, không có nuclease vào ống PCR đối chứng âm

+ Cho 5 µl ADN của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR

+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR.

CHÚ THÍCH:

1) Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

2) Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị.

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng tham khảo Bảng E.3, Phụ lục E.

- Kết quả của phản ứng realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

- Đánh giá kết quả:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh dịch tả vịt khi kết quả realtime PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

7.2.3.3 Phương pháp PCR

- Chuẩn bị mồi cho phản ứng PCR: Trình tự mồi phát hiện vi rút dịch tả vịt (tham khảo Bảng F.1, Phụ lục F).

CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi cần tham khảo khuyến cáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn mồi phù hợp.

- Sử dụng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Hot Start Taq Gold DNA polymerase 3) với nồng độ và thể tích tham khảo Bảng F.2, Phụ lục F.

- Tiến hành phản ứng PCR (tham khảo Phụ lục F)."

- Trên tế bào xơ phôi vịt

Sử dụng tế bào xơ phôi vịt (DEF) để gây nhiễm bằng huyễn dịch bệnh phẩm. Thu hoạch dịch nuôi tế bào và giám định vi rút bằng phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn trên môi trường tế bào DEF (xem Phụ lục C).

Phát hiện kháng thể trong việc chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt thế nào?

Tại Tiểu mục 7.3 Mục 7 TCVN 8400-11:2019 quy định việc phát hiện kháng thể vi rút dịch tả vịt trong huyết thanh vịt mắc bệnh hoặc đã được tiêm phòng vắc xin bằng phương pháp trung hòa huyết thanh với vi rút dịch tả vịt rồi tiêm trên phôi trứng vịt hoặc nhiễm trên tế bào xơ phôi vịt.

- Phương pháp trung hòa huyết thanh trên phôi trứng vịt:

+ Pha loãng huyết thanh cần phát hiện kháng thể thành các nồng độ từ 1/5, 1/10, 1/20 đến 1/1280. Trung hòa huyết thanh với liều 1000 ELD50 (hoặc 100 EID50) vi rút dịch tả vịt.

+ Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt (mỗi nồng độ tiêm 5 phôi), theo dõi trứng trong 10 ngày, sau đó mổ khám trứng chết và sống kiểm tra bệnh tích phôi.

+ Tính toán chỉ số trung hòa NI và hiệu giá trung hòa (xem Phụ lục B).

- Phương pháp trung hòa huyết thanh trên tế bào xơ phôi vịt:

+ Pha loãng huyết thanh cần phát hiện kháng thể thành các nồng độ từ 1/5, 1/10, 1/20 đến 1/1280. Trung hòa huyết thanh với liều 100 TCID50 vi rút dịch tả vịt.

+ Gây nhiễm hỗn hợp trên lên tế bào xơ phôi vịt, theo dõi, kiểm tra bệnh tích tế bào trên môi trường nuôi cấy. Tính toán chỉ số trung hòa NI và hiệu giá trung hòa (xem Phụ lục C).

Kết luận kết quả chẩn đoán bệnh dịch tả ở vịt tại phòng thí nghiệm thế nào?

Việc kết luận thực hiện theo Mục 8 TCVN 8400-11:2019 như sau:

Vịt, ngan, ngỗng được xác định mắc bệnh dịch tả vịt khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh dịch tả vịt và phải có kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:

- Phân lập được vi rút trên phôi trứng vịt hoặc tế bào DEF và kết quả giám định dương tính vi rút dịch tả vịt.

- Phương pháp PCR cho kết quả dương tính.

- Phương pháp realtime PCR cho kết quả dương tính.

- Đối với con vật chưa tiêm phòng vắc xin dịch tả vịt có kết quả dương tính khi thực hiện phương pháp trung hòa huyết thanh trên phôi trứng vịt hoặc trên tế bào DEF.