Phương pháp ELISA dùng để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn có bao nhiêu bước thực hiện?

Nội dung chính

• Để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thì huyết thanh dùng xét nghiệm kháng thể cần lấy bao nhiêu mẫu trong một đàn?
• Dùng phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể nhằm chẩn đoán hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn thì mẫu huyết thanh cần được xử lý ra sao?
• Phương pháp ELISA dùng để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn có bao nhiêu bước thực hiện?

Để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thì huyết thanh dùng xét nghiệm kháng thể cần lấy bao nhiêu mẫu trong một đàn?

Theo tiết 5.2.1.2 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) quy định về số lượng mẫu huyết thanh cần lấy để xét nghijeejm kháng thể như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.1.2. Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể

Mẫu lấy xét nghiệm kháng thể là huyết thanh từ 0,5 đến 1 ml của lợn cần kiểm tra: dùng bơm tiêm (xem 4.22) lấy máu lợn cần kiểm tra (khoảng 3 ml - 4 ml), đặt nghiêng, yên tĩnh cho máu đông và tránh dung huyết, sau đó chắt lấy huyết thanh giữ trong ống giữ mẫu (xem 4.23) cho xét nghiệm.

CHÚ THÍCH : Đối với xét nghiệm kháng thể, không lấy mẫu chất huyết thanh của lợn được tiêm vắc xin PRRS và kể cả lợn con sinh ra từ nái mẹ đã được tiêm vắc xin PRRS. Nếu lấy mẫu huyết thanh để xét nghiệm, cần lấy 3 mẫu/đàn (đối với đàn có từ 3 con trở lên).

Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải được bao gói cẩn thận không làm lây lan bệnh, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm nhất có thể (trong vòng 24 h) (kèm theo phiếu bệnh phẩm). Tại phòng thí nghiệm mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ âm sâu -70 °C.

...

Theo đó, nếu lấy mẫu huyết thanh lợn để xét nghiệm kháng thể nhằm chẩn đoán hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản thì cần ấy 3 mẫu/đàn (đối với đàn có từ 3 con trở lên).

Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải được bao gói cẩn thận không làm lây lan bệnh, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm nhất có thể (trong vòng 24 h) (kèm theo phiếu bệnh phẩm). Tại phòng thí nghiệm mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ âm sâu -70 °C.

Dùng phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể nhằm chẩn đoán hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn thì mẫu huyết thanh cần được xử lý ra sao?

Theo tiết 5.2.3.2 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) quy định về việc xử lý mẫu huyến thanh dùng trong phương pháp ELISA như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.3.1. Xử lý bệnh phẩm

Bệnh phẩm là huyết thanh (xem 5.2.1.2): lắc bằng máy lắc trộn (xem 4.7), rồi ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (xem 4.5) ở gia tốc 8000 g trong 1 min. Sau đó xử lý ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min để diệt bổ thể rồi đem tiến hành các phương pháp để phát hiện kháng thể.

...

Sau khi lấy được đủ số lượng mẫu huyết thanh cần thiết của lợn có triệu chứng mắc bệnh thì tiến hành lắc huyết thanh bằng máy lắc trộn, rồi ly tâm nhanh bằng máy ly tâm ở gia tốc 8000 g trong 1 min. Sau đó xử lý ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min để diệt bổ thể rồi đem tiến hành các phương pháp để phát hiện kháng thể.

Phương pháp ELISA dùng để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn có bao nhiêu bước thực hiện?

Phương pháp ELISA dùng để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn có bao nhiêu bước thực hiện? (Hình từ Internet)

Theo Phụ lục D ban hành kèm theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) thì phương pháp ELISA có 10 bước thực hiện khi sử dụng bộ kit chẩn đoán PRRS-HERDCHECK X3 của IDEXX, cụ thể như sau:

- Bước 1: Chuẩn bị bộ kit: số mẫu huyết thanh cần kiểm tra (xem 5.2.3.1) + 02 đối chứng dương + 02 đối chứng âm.

- Bước 2: Pha loãng mẫu huyết thanh cần kiểm tra với tỷ lệ 1/40: 10 μl mẫu kiểm tra + 390 μl dung dịch pha loãng mẫu trong ống pha loãng. Sau đó chuyển 100 μl dung dịch mẫu kiểm tra đã pha loãng sang đĩa ELISA với sơ đồ bố trí mẫu tương ứng.

Nhỏ 100 μl đối chứng âm và đối chứng dương (không pha loãng) vào đĩa ELISA theo vị trí bố trí.

- Bước 3: Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 min.

- Bước 4: Pha nước rửa đĩa 1X từ dung dịch rửa đĩa 10X có sẵn trong bộ kit với nước cất.

- Bước 5: Sau 30 min ủ đĩa, đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với lượng 300 μl/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X.

- Bước 6: Nhỏ 100 μl chất gắn kết (conjugate) vào tất cả các giếng. Ủ tiếp đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min.

- Bước 7: Sau đó đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với lượng 300 μl/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X.

- Bước 8: Nhỏ 100 μl cơ chất vào các giếng, ủ đĩa trong 15 min.

- Bước 9: Dừng phản ứng bằng cách cho 100 μl dung dịch stop vào các giếng.

- Bước 10: Đọc đĩa ở bước sóng 650 nm và tính kết quả.

Phản ứng được công nhận khi OD của đối chứng âm ≤ 0,15 hoặc OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm ≥ 0,15

Mẫu huyết thanh được xác đinh là dương tính khi S/P không nhỏ hơn 0,4 và được xác định là âm tính khi S/P nhỏ hơn 0,4.

Chỉ số S/P sẽ đước tính theo công thức: S/P = (OD của mẫu - OD của đối chứng âm)/(OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm)