Phương pháp PCR được thực hiện theo các bước như thế nào để chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà?

Nội dung chính

• Để thực hiện phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà thì chuẩn bị những gì?
• Phương pháp PCR được thực hiện theo các bước như thế nào để chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà?
• Kết quả của phương pháp PCR cho kết quả dương tính với bệnh viêm ruột hoại tử khi nào?

Để thực hiện phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà thì chuẩn bị những gì?

Theo điểm C.1 và điểm C.2 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-28:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn clostridium perfringens quy định về bước chuẩn bị cho phương pháp PCR như sau:

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp PCR kiểm tra các yếu tố độc lực

C.1 Nguyên liệu PCR

C.1.1 Taq PCR Master Mix Kit

C.1.2 Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (xem bảng 3)

C.1.3 Nước tinh khiết không có nuclease

C.1.4 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

C.1.5 Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

C.1.6 Loading dye

C.1.7 ADN (Acid Deoxyribo Nucleic) chuẩn (Ladder, marker)

C.2 Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là vi khuẩn Clostridium perfringens đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu (3.2) ở tủ ấm (4.1) trong điều kiện yếm khí (4.3) có bổ sung CO2 (3.4), từ 24 h đến 48 h.

Đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được giám định là Clostridium perfringens hoặc sử dụng các chủng Clostridium perfringens chuẩn.

Theo quy định trên thì để thực hiện phương pháp PCR thì người tiến hành thí nghiệm cần chuẩn bị một số nguyên liệu như:

- Taq PCR Master Mix Kit

- Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (xem bảng 3)

- Nước tinh khiết không có nuclease

- Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

- Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

- Loading dye

- ADN (Acid Deoxyribo Nucleic) chuẩn (Ladder, marker)

Ngoài ra cũng cần phải chuẩn bị một mẫu kiểm tra là vi khuẩn Clostridium perfringens đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu ở tủ ấm (4.1) trong điều kiện yếm khí có bổ sung CO2 (3.4), từ 24 h đến 48 h.

Phương pháp PCR được thực hiện theo các bước như thế nào để chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà?

Theo điểm C.3, C,4 và điểm C.5 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-28:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn clostridium perfringens quy định về các bước tiến hành phương pháp PCR như sau:

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp PCR kiểm tra các yếu tố độc lực

...

C.3 Tách chiết ADN

Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết ADN bằng các kit thương mại hoặc bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa các enzym Rnase và se (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (4.4) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

C.4 Tiến hành

Có thể sử dụng các kit thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nên sử dụng Multiplex PCR kit.

Sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt trong Bảng 3.

Đối chứng dương: tách chiết từ vi khuẩn Clostridium perfringens (xem mục C.3).

Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có ADN của vi khuẩn.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.5).

C.5 Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 µl dung dịch loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 µl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian 30 min đến 40 min, ở 100 V.

Sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg / 100ml.

Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ như SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

...

Như vậy, phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà được tiến hành theo 03 bước: tách chiết ADN, tiến hành phản ứng PCR và cuối cùng là điện di sản phẩm theo tiêu chuẩn nêu trên.

Phương pháp PCR được thực hiện theo các bước như thế nào để chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà? (Hình từ Internet)

Kết quả của phương pháp PCR cho kết quả dương tính với bệnh viêm ruột hoại tử khi nào?

Theo điểm C.6 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-28:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn clostridium perfringens quy định về kết quả của phương pháp PCR như sau:

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp PCR kiểm tra các yếu tố độc lực

...

C.6 Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra không có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Theo đó mẫu đối chứng cho kết quả dương tính với bệnh viêm ruột hoại tử khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.