Phương pháp Realtime RT PCR được tiến hành như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1?

Nội dung chính

• Gà mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 thì sẽ có dấu hiệu bệnh tích như thế nào?
• Để thực hiện phương pháp Realtime RT-PCR để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 ở gà thì cần chuẩn bị những gì?
• Phương pháp Realtime RT PCR được tiến hành như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1?

Gà mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 thì sẽ có dấu hiệu bệnh tích như thế nào?

Gà mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 thì sẽ có dấu hiệu bệnh tích như thế nào? (Hình từ Internet)

Theo tiểu mục 5.1.3 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-26:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1 thì gà khi mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 thì gà mức bệnh cúm gia cầm H5N1 sẽ có các những dấu hiệu bệnh tích như sau:

Ở thể độc lực cao trrên gà sẽ có một số dấu hiệu bệnh tích như:

- Xuất huyết tràn lan ở các bề mặt niêm mạc, màng thanh dịch và mỡ bụng;

- Xuất huyết tụy, màng ngoài bao tim, lớp màng ngoài bao tim, cơ ngực, chân;

- Xuất huyết dạ dày và dạ dày tuyến, ruột, manh tràng;

- Phù thũng dưới da vùng đầu, cổ và ngực;

- Miệng chứa nhiều dịch;

- Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhày;

- Gà đẻ có xuất huyết ở buồng trứng.

Ở thể độc lực thấp trrên gà sẽ có một số dấu hiệu bệnh tích như:

- Nang buồng trứng xuất huyết, phù nề

- Vòi trứng phù, viêm cata

- Viêm phúc mạc fibrin lẫn lòng vàng trứng

- Xung huyết phổi, khí quản, phù phổi

- Xuất huyết điểm màng ngoài tim, gan, màng thanh dịch ruột.

Để thực hiện phương pháp Realtime RT-PCR để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 ở gà thì cần chuẩn bị những gì?

Theo điểm a tiết 5.2.2.2 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-26:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1 quy định về chiết tách ARN như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

5.2.2.2. Phương pháp Realtime RT-PCR

a) Chiết tách ARN

Sau khi xử lý mẫu, tiến hành chiết tách ARN đối với các dịch bệnh phẩm bằng kit thương mại (xem phụ lục D). ARN thu được sau quá trình chiết tách dùng làm mẫu xét nghiệm

...

Theo đó, để thực hiện được phương pháp Realtime RT PCR thì trước tiên cần thực hiện tách tách ARN đối với các dịch bệnh phẩm để dùng ARN thu được làm mẫu xét nghiệm trong phương pháp Realtime RT PCR chẩn đoán đoán bệnh cúm gia cầm H5N1

Dẫn chiếu Phụ lục D Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-26:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1 quy định về việc chiết tách ARN như sau:

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp chiết tách ARN

Dùng huyễn dịch đã xử lý (xem 5.2.2.1) để chiết tách ARN. Có thể sử dụng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình dưới đây:

Nhỏ 200μl dịch nghiền mô vào ống ly tâm loại 1,5ml cùng với 600μl Qiagen® buffer RLT có 1 % β-ME, lắc đều trên máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.

Thêm 500 μl etanol 70 % (xem 3.3) vào ống, lắc mạnh bằng máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.

Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với tốc độ 10.000 r/min ở nhiệt độ phòng.

Bổ sung 700 μl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s ở 10.000 g/min, thay ống thu mới vào cột lọc.

Nhỏ 500 μl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở 10.000 g/min, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ 12.000 g/min trở lên, bỏ ống thu.

Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 μl nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min ở tốc độ 10.000 g/min, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu để sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở - 20 °C hoặc nhiệt độ thấp hơn.

Như vậy, việc chiết tách ARN để thu mẫu làm xét nghiệm được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Phương pháp Realtime RT PCR được tiến hành như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1?

Theo điểm b và điểm c tiết 5.2.2.2 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-26:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1 quy định về cách tiến hành và kết quả của phương pháp Realtime RT PCR như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

5.2.2.2. Phương pháp Realtime RT-PCR

...

b) Tiến hành phản ứng

Phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút cúm gia cầm trên cơ sở phát hiện các đoạn gen M, H5 và N1 được thực hiện như sau:

Lựa chọn mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime RT-PCR: cần tham khảo các báo cáo giám sát để biết để lựa chọn mồi và mẫu dò phù hợp với các chủng vi rút đang lưu hành. Các bộ mồi và mẫu dò để phát hiện các chủng vi rút H5N1 lưu hành được liệt kê trong Bảng E.1 phụ lục E.

Chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM và mẫu dò ở nồng độ 6 μM với nước sạch Dnase/Rnase.

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng Realtime RT-PCR phát hiện các đoạn gen M, H5, N1 theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng (Bảng E2 và E3 phụ lục E).

c) Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) có giá trị Ct ≤ 25 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct.

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính. Mẫu không có Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng định.

...

Để thực hiện phương pháp Realtime RT PCR cần lựa chọn mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime RT-PCR: cần tham khảo các báo cáo giám sát để biết để lựa chọn mồi và mẫu dò phù hợp với các chủng vi rút đang lưu hành. Các bộ mồi và mẫu dò để phát hiện các chủng vi rút H5N1 lưu hành được liệt kê trong Bảng E.1 Phụ lục E Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-26:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1

Chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM và mẫu dò ở nồng độ 6 μM với nước sạch Dnase/Rnase.

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng Realtime RT-PCR phát hiện các đoạn gen M, H5, N1 theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng

Nếu mẫu đối chứng có giá trị Ct ≤ 25 (± 2 Ct) thì mẫu xét nghiệm dương tính, mẫu đối chứng âm tính khi không có Ct. Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính.

Mẫu xét nghiệm có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ, những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng định.