Phương pháp trung hòa tế bào dương tính để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn được chỉ được thực hiện khi nào?

Nội dung chính

• Phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn được chỉ được thực hiện khi nào?
• Phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn được thực hiện ra sao?
• Kết quả của phương pháp trung hòa vi rút trên tế bào dương tính như thế nào thì có thể kết luận mẫu bệnh phẩm dương tính?

Phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn được chỉ được thực hiện khi nào?

Theo Mục 8 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 1: Bệnh lở mồm long móng quy định về trường hợp được áp dụng phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính như sau:

Kết luận

Gia súc được xác định mắc bệnh lở mồm long móng khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh lở mồm long móng và phải có kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:

- Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên dương tính.

- Phương pháp RT-PCR phát hiện vi rút dương tính.

- Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút dương tính.

- Phân lập được vi rút trên môi trường tế bào, và giám định vi rút lở mồm long móng dương tính.

- Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể dương tính ở gia súc chưa tiêm phòng.

- Phương pháp ELISA FMD-3ABC phát hiện kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng do nhiễm tự nhiên dương tính.

- Phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính (chỉ áp dụng đối với gia súc chưa tiêm phòng trong trường hợp chẩn đoán).

Theo đó, phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn chỉ áp dụng đối với lợn có triệu chứng mắc bệnh nhưng chưa tiêm phòng.

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn (Hình từ Internet)

Phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn được thực hiện ra sao?

Theo điểm H.1, H.2 và điểm H.3 Phụ lục H Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 1: Bệnh lở mồm long móng quy định về các bước thực hiện phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính như sau:

Phương pháp trung hòa vi rút trên tế bào động vật (VNT)

Mẫu huyết thanh phải được xử lý nhiệt ở 56 °C trong 30 phút trước khi xét nghiệm.

Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng với 100TCID50/ 50 µl.

H.1 Thực hiện trên đĩa phản ứng: Huyết thanh pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512.

- Mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.

- Cho 50 µl dung dịch vi rút với 100 TCID50 /50 µl vào các giếng.

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút

- Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK 21 (106 tế bào/ml trong môi trường chứa 10 % FBS) vào tất cả các giếng

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 48 giờ.

Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược (5.4.4) để ghi nhận bệnh tích tế bào.

H.2 Thực hiện trên đĩa đối chứng

- Đối chứng huyết thanh: Huyết thanh đối chứng âm và dương tính (đã biết trước hiệu giá kháng thể) pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512.

+ Mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.

+ Cho 50 µl dung dịch vi rút với 100TCID50 / 50 µl vào các giếng.

+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút

+ Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK 21 (106 tế bào/ml) vào tất cả các giếng

+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 48 giờ

- Đối chứng tế bào

+ Cho 100 µl môi trường vào giếng A6 đến D6 và A7 đến D7.

+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút

- Đối chứng môi trường

+ Cho 150 µl môi trường vào giếng E6 đến H6 và E7 đến H7.

+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút

H.3 Chuẩn độ lại vi rút sử dụng

- Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng: từ 10-1 đến 10-4

- Cho 50 µl môi trường vào các giếng từ A9 đến H12.

- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10-1 và các giếng từ A9 đến H9.

- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10-2 và các giếng từ A10 đến H10.

- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10-3 và các giếng từ A11 đến H11.

- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10-4 và các giếng từ A12 đến H12.

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút

Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK 21 (106 tế bào/ml) vào tất cả các giếng từ A1 đến H4, từ A6 đến D6, từ A7 đến D7 và từ A9 đến H12

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO2 trong 60 phút

- Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược (5.4.4) để ghi nhận bệnh tích tế bào.

...

Theo đó, các bước tiên hành phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Kết quả của phương pháp trung hòa vi rút trên tế bào dương tính như thế nào thì có thể kết luận mẫu bệnh phẩm dương tính?

Theo điểm H.6 Phụ lục H Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 1: Bệnh lở mồm long móng quy định về kết luật của phương pháp trung hòa trên tế bào dương tính như sau:

Phương pháp trung hòa vi rút trên tế bào động vật (VNT)

...

H.6 Kết luận

- Mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa 50 % ≥ 1,65 (1/45) được xem là mẫu dương tính.

- Mẫu không có hiệu kháng thể trung hòa 50 % ≤ 1,2 (1/16) được xem là mẫu âm tính.

- Mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa từ 50 % từ 1,2(1/16) đến 1,65 (1/45) được xem là mẫu nghi ngờ. Nếu mẫu kiểm tra lại lần 2 có hiệu giá > 1,2 (1/16) được xem là mẫu dương tính.

Như vậy, mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa 50 % ≥ 1,65 (1/45) được xem là mẫu dương tính. Nếu mẫu không có hiệu kháng thể trung hòa 50 % ≤ 1,2 (1/16) được xem là mẫu âm tính.

Trường hợp mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa từ 50 % từ 1,2(1/16) đến 1,65 (1/45) được xem là mẫu nghi ngờ. Nếu mẫu kiểm tra lại lần 2 có hiệu giá > 1,2 (1/16) được xem là mẫu dương tính.