Quá trình chạy điện di khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh còi ở tôm gồm mấy bước thực hiện?

Nội dung chính

• Thực hiện chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống bằng phương pháp RT PCR dựa trên nguyên tắc nào?
• Để có thể thực hiện phương pháp RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh còi ở tôm thì cần chuẩn bị các thiết bị dụng nào?
• Quá trình chạy điện di khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh còi ở tôm gồm mấy bước thực hiện?

Thực hiện chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống bằng phương pháp RT PCR dựa trên nguyên tắc nào?

Theo tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về phương pháp chẩn đoán bệnh ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

3.2.1 Phương pháp PCR

3.2.1.1 Nguyên tắc

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham ra của mồi, bốn loại gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn ADN đích thông qua các chu kì luân nhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại ADN đích gồm 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch, tổng hợp mạch ADN mới.

Phương pháp PCR tổ (nested PCR): là PCR có hai giai đoạn, giai đoạn đầu dùng cặp mồi ngoài (gọi là PCR vòng ngoài) để khuếch đại một đoạn ADN đích. Sau đó dùng sản phẩm PCR vòng ngoài này làm

khuôn cho vào ống PCR có cặp mồi trong (gọi là PCR vòng trong) để khuếch đại đoạn ADN trong đoạn ADN đích.

Nguyên tắc thực hiện phương pháp RT PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn ADN đích thông qua các chu kì luân nhiệt.

Quá trình chạy điện di khi thực hiện phương pháp RT PCR để chấn đoán bệnh còi ở tôm gồm mấy bước thực hiện? (Hình từ Internet)

Để có thể thực hiện phương pháp RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh còi ở tôm thì cần chuẩn bị các thiết bị dụng nào?

Theo tiểu mục 3.2.1.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về thuốc thử và vật liệu thử để thực hiện phương pháp RT PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

3.2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh. Yêu cầu cơ bản là phòng thử nghiệm cần có các khu vực riêng biệt để thao tác tách chiết ADN, tiến hành phản ứng PCR và điện di đọc kết quả.

- Tủ lạnh;

- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ -20 ºC;

- Máy li tâm, có thể hoạt động với vận tốc 13000 r/min.

- Tủ ấm, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 oC.

- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, , có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 ºC;

- Máy lắc trộn vortex;

- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg;

- Đèn cồn;

- Khay hay hộp đựng đá lạnh;

- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 2 µl đến 20 µl, từ 10 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl;

- Giá cho ống eppendof có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;

- Bộ kéo panh vô trùng, chày nghiền mẫu, bút đánh dấu, sổ ghi chép;

- Hộp đựng giấy thấm, găng tay, khẩu trang;

- Hộp đựng đầu típ micropipet các loại;

- Máy luân nhiệt (máy PCR);

- Bếp điện hoặc lò vi sóng;

- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;

- Bình nón bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung tích 250 ml;

- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;

- Buồng đổ gel;

- Bàn đọc gel (UV);

- Giấy parafin."

Như vậy, khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh ở tôm cần có các dụng cụ và thiết bị nêu trên.

Quá trình chạy điện di khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh còi ở tôm gồm mấy bước thực hiện?

Theo tiểu mục 3.2.1.5.3 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về quá trình thực hiện chạy điện đi như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.3 Chạy điện di

3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC thì cho vào 5 µl etidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn. Tiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm.

Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.1.5.3.2 Điện di

Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.

Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo AND marker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang ADN vào một giếng trên bản gel.

Điện di ở hiệu điện thế 100 volt đến 150 volt (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di.

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl loading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra,

Theo đó, quá trình chạy điện di trong phương pháp RT PCR chia làm hai bước bao gồm chuẩn bị bản gel và chạy điện. Các bước thực hiện của quán trình phải thực hiện đúng các bước theo Tiêu chuẩn nêu trên.