Quá trình phản ứng PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm tiến hành như thế nào? Mẫu thử có kết quả nhiễm bệnh hoại tử gan tụy ở tôm thì sẽ cho ra kết quả như thế nào?

Nội dung chính

• Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR gồm những cặp mồi nào?
• Quá trình phản ứng PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm tiến hành như thế nào?
• Mẫu thử có kết quả nhiễm bệnh hoại tử gan tụy ở tôm thì sẽ cho ra kết quả như thế nào?

Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR gồm những cặp mồi nào?

Theo tiết 3.2.1.5.2.1 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về cặp mồi trong phản ứng như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.2. Tiến hành phản ứng PCR

3.2.1.5.2.1. Cặp mồi ngoài sử dụng trong phản ứng PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt theo phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi Pf -1, Pr -1, xem Bảng 1.

Cặp mồi Pf -1/Pr -1 dùng để khuếch đại đoạn DNA của vi khuẩn NHP có kích thước 441 bp.

Chuẩn bị mồi:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease hoặc đệm TE (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

Như vậy, cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR là cặp mồi Pf-1 và Pr-1 nhằm khuếch đại đoạn DNA của vi khuẩn NHP có kích thước 441 bp.

Khi chuẩn bị mồi, người thực hiện chẩn đoán phải đảm bảo mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl.

Quá trình phản ứng PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm tiến hành như thế nào? Mẫu thử có kết quả nhiễm bệnh hoại tử gan tụy ở tôm thì sẽ cho ra kết quả như thế nào? (Hình từ Internet)

Quá trình phản ứng PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm tiến hành như thế nào?

Theo tiết 3.2.1.5.2.3 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR

Thêm 2,5 µl DNA mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, deoxynucleotide 200 mM, nồng độ 0,5 µM mỗi mồi Pf -1 và Pr -1, nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

Có thể sử dụng thành phần thuốc thử riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như trên, ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); dATP 400 µM; dGTP 400 µM; dTTP 400 µM; dCTP 400 µM; MgCl2 3 mM; Taq DNA polymerase và chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).

Ví dụ về hỗn hợp phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 2.

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được nêu trong Bảng 3.

CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng."

Theo đó, cách tiến hành phản ứng PCR được thực hiện theo các bước được quy định theo Tiêu chuẩn nêu trên

Người thực hiện phải đảm bảo nồng độ cuối cùng của đúng với số liệu tại bảng 2 nêu trên, ví dụ:

- Sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); dATP 400 µM; dGTP 400 µM; dTTP 400 µM; dCTP 400 µM; MgCl2 3 mM; Taq DNA polymerase và chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).

Cần chú ý mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Mẫu thử có kết quả nhiễm bệnh hoại tử gan tụy ở tôm thì sẽ cho ra kết quả như thế nào?

Theo tiết 3.2.1.5.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về kết quả sau khi chạy điện di như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5.4. Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.

Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 441bp. Thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm thanh không có vạch sáng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi: Không có vạch sáng kích thước 441bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, thang DNA phân vạch rõ ràng.

Sau khi chạy điện di trên mẫu thử thì có thể kết luận tôm mắc bệnh hoại tử gan tuy nếu trên mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 441bp. Thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm thanh không có vạch sáng.