Quá trình tách chiết ADN để chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống bằng phương pháp RT PCR được thực hiện như thế nào?

Nội dung chính

• Việc tách chiết ADN để chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống cần phải chuẩn bị những thiết bị dụng cụ nào?
• Có thể lấy những mẫu thử nào để tiến hành tách chiết ADN cho việc chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống?
• Quá trình tách chiết ADN để chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống bằng phương pháp RT PCR được thực hiện như thế nào?

Việc tách chiết ADN để chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống cần phải chuẩn bị những thiết bị dụng cụ nào?

Theo tiết 3.2.1.3 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về thiết bị, dụng cần cần thiết để tiến hành chẩn đoán bệnh còi ở tôm bằng phương pháp RT PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

3.2.1 Phương pháp PCR

3.2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh. Yêu cầu cơ bản là phòng thử nghiệm cần có các khu vực riêng biệt để thao tác tách chiết ADN, tiến hành phản ứng PCR và điện di đọc kết quả.

- Tủ lạnh;

- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ -20 ºC;

- Máy li tâm, có thể hoạt động với vận tốc 13000 r/min.

- Tủ ấm, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 oC.

- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, , có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 ºC;

- Máy lắc trộn vortex;

- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg;

- Đèn cồn;

- Khay hay hộp đựng đá lạnh;

- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 2 µl đến 20 µl, từ 10 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl;

- Giá cho ống eppendof có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;

- Bộ kéo panh vô trùng, chày nghiền mẫu, bút đánh dấu, sổ ghi chép;

- Hộp đựng giấy thấm, găng tay, khẩu trang;

- Hộp đựng đầu típ micropipet các loại;

- Máy luân nhiệt (máy PCR);

- Bếp điện hoặc lò vi sóng;

- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;

- Bình nón bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung tích 250 ml;

- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;

- Buồng đổ gel;

- Bàn đọc gel (UV);

- Giấy parafin."

Theo đó, khi thực hiện việc tách chiết ADN cũng như thực hiện cả quá trình chẩn đoán bệnh còi ở tôm bằng phương pháp RT PCR cần chuẩn bị các thiết bị và dụng cụ được nêu ở Tiêu chuẩn ở trên.

Quá trình tách chiết ADN để chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống bằng phương pháp RT PCR được thực hiện như thế nào? (Hình từ Internet)

Có thể lấy những mẫu thử nào để tiến hành tách chiết ADN cho việc chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống?

Theo tiết 3.2.1.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về cách lấy mẫu thử nghiệm ở tôm giống như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

3.2.1.4 Lấy mẫu

Tôm bố mẹ: lấy mẫu phân tôm bố mẹ.

Tôm giống (lớn hơn postlavare 8, hay hậu ấu trùng lớn hơn 8 ngày tuổi): lấy một phần khối gan tụy, lấy khoảng 10 con đến 15 con.

Tôm nhỏ hơn tôm giống (nhỏ hơn postlavare 8): lấy phần đầu khoảng 10 con đến 15 con. Ấu trùng biến thái: lấy cả con, khoảng 50 con.

Lượng mẫu lấy để tách chiết ADN khoảng 20 mg, có thể dùng tôm còn sống hoặc mẫu tôm, mẫu phân cố định trong cồn 95 % để tách chiết ADN."

Theo đó, lượng mẫu lấy để tách chiết ADN khoảng 20 mg, có thể dùng tôm còn sống hoặc mẫu tôm, mẫu phân cố định trong cồn 95 % để tách chiết ADN.

Đối với mẫu tôm giống dùng để tách chiết ADN phải lấy một phần khối gan tụy, lấy khoảng 10 con đến 15 con.

Quá trình tách chiết ADN để chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống bằng phương pháp RT PCR được thực hiện như thế nào?

Theo tiết 3.2.1.5.1 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về quá trình tách chiết ADN như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

3.2.1.5 Cách tiến hành

3.2.1.5.1 Tách chiết ADN

CHÚ THÍCH: Hiện nay có rất nhiều thuốc thử và bộ kít thương mại tiện lợi cho việc tách chiết ADN (QiaGen, Promega…). Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ví dụ quy trình tách chiết ADN bằng dung dịch đệm chiết tách (Lysis Buffer) (kít IQ2000MBV): Cho mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml.

Nếu mẫu cố định trong cồn 95 %, cần làm khô cồn bằng cách: đổ cồn và dốc ngược trên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên.

Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 µl đến 200 µl dung dịch tách chiết, nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng 300 µl đến 400 µl dung dịch tách chiết và nghiền tiếpđến khi nhuyễn.

Ủ mẫu ở nhiệt độ 95 oC trong 10 min, ly tâm 12000 r/min trong thời gian 10 min.

Chuyển 200 µl phần dịch nổi sang ống Eppendorf mới có chứa 400 µl cồn 95 %, trộn trên máy lắc trộn vortex hoặc lắc nhẹ.

Ly tâm 12000 r/min trong thời gian 5 min, sau đó loại bỏ cồn và làm khô mẫu.

Hòa tan ADN bằng nước tinh khiết hoặc dung dịch đệm TE 1X với lượng khoảng từ 50 µl đến 200 µl tùy thuộc vào lượng ADN tách chiết được.

CẢNH BÁO AN TOÀN: Tách chiết axít nucleic phụ thuộc vào việc phân giải hay hoà tan của các mô và sự phân tách của axít nucleic từ hỗn hợp kết cấu phức tạp. Hầu như các quy trình đều sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này."

Như vậy, quá trình tách chiết ADN để chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống được thực hiện theo trình tự trên.

Cần chú ý rằng hầu như các quy trình đều sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.