Quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thực hiện như thế nào?

Nội dung chính

• Có thể sử dụng loại kit tách chiết ADN nào trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm?
• Quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thực hiện như thế nào?
• Tôm được xác định là dương tính với bệnh vi bào tử khi phương pháp PCR cho kết quả chẩn đoán như thế nào?

Có thể sử dụng loại kit tách chiết ADN nào trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm?

Theo tiết 6.1.4 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về tách chiết ADN như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

...

6.1.4 Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Qiagen, Cat No. 69506)[1]) (xem phụ lục B).

..."

Theo Tiêu chuẩn nêu trên thì kit tách chiết ADN sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm không được quy định cụ thể.

Người thực hiện chẩn đoán có thể sử dụng bất kì loại kit tách chiết ADN nào miễn thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Có thể sử dụng kít tách chiết ADN: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Qiagen, Cat No. 69506) theo Tiêu chuẩn vừa nêu để thực hiện quá trình tách chiết ADN với phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm.

Quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thực hiện như thế nào? (Hình từ Internet)

Quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thực hiện như thế nào?

Theo Phục lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định quy định về quy trình tách chiết ADN như sau:

"B1. Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy® Blood & Tissue Kit (250)

Nhỏ 20 µl proteinase K vào ống ly tâm 1,5 ml.

- Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống ly tâm đã có proteinase K.

- Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer).

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).

- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).

- Thêm 200 µl etanol (từ 96 % đến 100 %) (3.1.1) vào ống ly tâm.

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).

- Hút 420 µl huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới.

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.

- Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới.

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.

- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm.

- Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới.

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng.

- Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml.

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min.

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min.

- Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện ký sinh trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây bệnh trên tôm."

Theo đó, quy trình tách chiết ADN được thực hiện theo Tiêu chuẩn vừa nêu trê. Cần lưu ý là mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện ký sinh trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây bệnh trên tôm.

Tôm được xác định là dương tính với bệnh vi bào tử khi phương pháp PCR cho kết quả chẩn đoán như thế nào?

Theo tiết 6.1.5.3.3 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bảo tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về việc đọc kết quả chẩn đoáng bệnh vi bào tử bằng phương pháp PCR như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

...

6.1.5.3.3 Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 510 bp.

Với điều kiện phản ứng trên:

Kết quả mẫu thử dương tính khi:

- Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 510 bp.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi:

- Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng"

Như vậy, mẫu kết quả sau khi thực hiện phương pháp PCR được xác định là dương tính khi:

- Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 510 bp.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.

Bên cạnh đó, người thực hiện chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm bằng phương pháp PCR cần lưu y rằng điều kiện phản ứng chỉ được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 510 bp.