Quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá được thực hiện như thế nào?

Nội dung chính

• Thiết bị dụng cụ cần dùng trong việc chứng đoán hội chứng lở loét ở cá gồm những thiết bị dụng cụ nào?
• Mẫu cá có dấu hiệu nhiễm hội chứng lở loét dùng để chứng đoán trong phòng thí nghiệm cần phải bảo quản ở nhiệt độ bao nhiêu?
• Quá trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá được thực hiện như thế nào?

Thiết bị dụng cụ cần dùng trong việc chứng đoán hội chứng lở loét ở cá gồm những thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định về thiết bị dụng cụ như sau:

"4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học về những thiết bị, dụng cụ sau

4.1. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR.

4.1.1. Máy nhân gen (PCR).

4.1.2. Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

4.1.3. Máy lắc trộn vortex.

4.1.4. Máy spindown.

4.1.5. Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.1.6. Máy đọc gel.

4.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin.

4.2.1. Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.2. Máy xử lý mẫu mô tự động.

4.2.3. Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.

4.2.4. Khay sắt, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.5. Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.

4.2.6. Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ mỏng từ 3 µm đến 5 µm.

4.2.7. Nồi dãn tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.

4.2.8. Phiến kính, vô trùng.

4.2.9. Lamen, vô trùng.

4.2.10. Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20 X, 40 X và 100 X"

Theo đó, mốt số thiết bị dùng trong phương pháp PCR nhằm chấn đoán hội chứng lở loét ở cần gồm

- Máy nhân gen (PCR).

- Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

- Máy lắc trộn vortex.

- Máy spindown.

- Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

- Máy đọc gel.

Quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá được thực hiện như thế nào? (Hình từ Internet)

Mẫu cá có dấu hiệu nhiễm hội chứng lở loét dùng để chứng đoán trong phòng thí nghiệm cần phải bảo quản ở nhiệt độ bao nhiêu?

Theo tiết 6.1.2 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định về nhiệt độ bảo quản mẫu bệnh phẩm như sau:

"6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).

...

6.1.2. Bảo quản mẫu.

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối (3.1.1);

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.1.1).

..."

Như vậy, sau khi lấy đủ mẫu cá có dấu hiệu nhiễm bệnh cần thiết thì phải bảo quản mẫu bệnh ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối.

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol tuyệt đối.

Quá trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá được thực hiện như thế nào?

Theo Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định quy trình tách chiết ADN như sau:

"CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNAeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506):

- Nhỏ 20 µl protease K vào ống Iy tâm 1,5 ml;

- Chuyển 30 mg bệnh phẩm (6.1.3) vào ống ly tâm đã có protease K;

- Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer):

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4);

- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4 1.4):

- Thêm 200 µl etanol tuyệt đối (từ 96 % đến 100 %) (3.1.1) vào ống ly tâm;

- Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4);

- Hút 420 µl huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới:

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột ly tâm;

- Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới:

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml;

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác."

Như vậy, quy trình tách chiết ADN được thực hiện theo các bước theo Tiêu chuẩn nêu trên.

Một số việc cần lưu ý khi thực hiện quy trình tách chiết ADN như:

- Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận.

- Nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này.

- Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác.