Quy trình tách chiết RNA trong phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm thực hiện như thế nào?

Nội dung chính

• Cần dùng thuốc thử và vật liệu thử khi thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm?
• Khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh thì người thực hiện cần có những thiết bị, dụng cụ nào?
• Quy trình tách chiết RNA trong phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm thực hiện như thế nào?

Cần dùng thuốc thử và vật liệu thử khi thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm?

Theo tiết 3.2.1.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định thuốc thử và vật liệu thử khi thực hiện phương pháp RT PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.2.1. Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã ngược)

...

3.2.1.2. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.

- Trizol;

- Cloroform;

- Isopropanol;

- Etanol 75 % và 95 %;

- Dung dịch TBE 1X

Chuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X): hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, thêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X.

- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh đến pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

- Dung dịch DEPC

Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ - 20 oC

- Dung dịch TE (Tris - EDTA)

Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6.

- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR.

- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X).

- Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp.

- Etidi bromua (EtBr).

CẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp xúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay và mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.

- Gel agarose."

Như vậy, thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp RT PCR bao gồm:

- Trizol;

- Cloroform;

- Isopropanol;

- Etanol 75 % và 95 %;

- Dung dịch TBE 1X;

- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic);

- Dung dịch DEPC;

- Dung dịch TE (Tris - EDTA);

- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR.

- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X).

- Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp.

- Etidi bromua (EtBr).

Quy trình tách chiết RNA trong phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm thực hiện như thế nào? (Hình từ Internet)

Khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh thì người thực hiện cần có những thiết bị, dụng cụ nào?

Theo tiết 3.2.1.3 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định thuốc thử và vật liệu thử khi thực hiện phương pháp RT PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.2.1. Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã ngược)

...

3.2.1.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Tủ lạnh;

- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ - 20 oC;

- Máy li tâm, có thể hoạt động với gia tốc 13000 g;

- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 oC;

- Máy lắc trộn vortex;

- Cân phân tích có thể cân chính xác đến 0,1 mg;

- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 l đến 10 l, từ 2 l đến 20 l, từ 10 l đến 100 l, từ 100 l đến 1000 l;

- Giá Eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;

- Máy luân nhiệt (máy PCR);

- Bếp điện hoặc lò vi sóng;

- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;

- Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml;

- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;

- Buồng đổ gel;

- Bàn đọc gel (UV);

- Giấy parafin."

Theo đó, người thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp RT PCR cần chuẩn bị những thiết bị, dụng cụ nêu trên để tiến hành chẩn đoán.

Quy trình tách chiết RNA trong phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm thực hiện như thế nào?

Theo tiết 3.2.1.5.1 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về quy trình tách chiết RNA phương pháp RT PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.2.1. Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã ngược)

...

3.2.1.5. Cách tiến hành

3.2.1.5.1. Tách chiết RNA

CHÚ THÍCH: Có nhiều quy trình tách chiết RNA từ mô động vật theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hiện nay có rất nhiều các thuốc thử và bộ kit thương mại hữu ích cho việc tách chiết RNA…) Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kit thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phương pháp tách chiết RNA bằng trizol:

Cho 20 mg mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml. Nếu mẫu được cố định trong etanol 95 %, cần làm khô etanol bằng cách đổ etanol và dốc ngược trên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên.

Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 l đến 200 l dung dịch trizol (lượng mẫu không quá 10 % trizol).

Nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng 550 l đến 650 l dung dịch trizol và nghiền tiếp đến khi nhuyễn. Giữ ở nhiệt độ phòng đến 5 min.

Ly tâm 12000 g trong thời gian 10 min, sau đó chuyển dịch trong sang ống Eppendorf mới, nhỏ thêm 150 l cloroform. Lắc cẩn thận bằng tay trong 15 s.

Ủ 15 oC đến 30 oC từ 2 min đến 3 min.

Ly tâm 12000 g từ 2 oC đến 8 oC trong 15 min, sau đó chuyển phần trong phía trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.

Thêm 375 l dung dịch isopropanol, ủ ở 15 oC đến 30 oC trong 10 min.

Ly tâm 12000 g tại 4 oC trong 10 min, sau đó rút bỏ isopropanol.

Rửa phần viên bằng 750 l etanol 75 %.

Trộn đều bằng máy vortex và ly tâm ở 7500 g trong 5 min ở 4 oC, sau đó rút bỏ etanol. Làm khô phần viên.

Hòa tan RNA bằng nước tinh khiết hoặc DEPC (dietyl pyrocarbonat) với lượng khoảng từ 50 l đến 100 l tùy thuộc vào lượng RNA tách chiết được.

CẢNH BÁO: Việc tách chiết RNA sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này."

Như vậy, việc tách chiết RNA được thực hiện theo các bước được quy định tại Tiêu chuẩn vừa nêu trên.

Việc tách chiết RNA sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận.

Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này, luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.