Số lượng mẫu bệnh phẩm dùng để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá trong phương pháp nhuộm HE có khác với phương pháp Nested RT PCR hay không?

Nội dung chính

• Số lượng mẫu bệnh phẩm dùng để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá trong phương pháp nhuộm HE có khác với phương pháp Nested RT PCR hay không?
• Quá trình chuẩn bị mẫu cho việc chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá bằng phương pháp nhuộm He ra sao?
• Chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá bằng phương pháp nhuộm HE như thế nào?

Số lượng mẫu bệnh phẩm dùng để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá trong phương pháp nhuộm HE có khác với phương pháp Nested RT PCR hay không?

Bệnh hoại tử thần kinh ở cá (Hình từ Internet)

Theo tiết 6.1.1 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về số lượng mẫu bệnh phẩm dùng trong phương pháp Nested RT PCR như sau:

6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp Nested RT - PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

6.1.1 Lấy mẫu

Cá <1 cm: Lấy nguyên con từ 5 -10 con

Cá từ 1 đến 6 cm: Lấy phần đầu bao gồm mắt, não của 3-5 con

Cá lớn: Lấy não, mắt

Cá bố mẹ: Lấy não, mắt, Trứng, sẹ

Lượng mẫu lấy để tách chiết ARN khoảng 30 mg.

Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm PBS (3.1.2), để tạo thành huyễn dịch 10 % (sử dụng cân phân tích cân trọng lượng mẫu được nghiền để điều chỉnh lượng dung dịch PBS (3.1.2) nhằm đảm bảo tạo được huyễn dịch 10%).

...

Bên cạnh đó, tại tiết 6.3.1 tiểu mục 6.3 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định vế số lượng mẫu bệnh phẩm dùng trong phương pháp nhuộm HE như sau:

6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.3 Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

6.3.1 Lấy mẫu

- Cá <1cm: Lấy nguyên con từ 5 -10 con

- Cá từ 1 đến 6 cm: Lấy phần đầu bao gồm mắt, não của 3-5 con

- Cá lớn, Cá bố mẹ: Lấy não, mắt.

Theo đó, mẫu bệnh phẩm dùng để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh của cá ở cả hai phương pháp là gần giống nhau.

Khác biệt duy nhất là ở phương pháp Nested RT PCR thì có quy định thêm về mẫu bệnh phẩm đối với cá bố mẹ là sẽ lấy não, mắt, Trứng, sẹ.

Quá trình chuẩn bị mẫu cho việc chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá bằng phương pháp nhuộm He ra sao?

Theo tiết 6.3.3 tiểu mục 6.3 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về việc chuẩn bị mẫu cho phương pháp nhuộm HE như sau:

6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.3 Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

6.3.3 Chuẩn bị mẫu

- Đối với cá nhỏ lấy nguyên con, đối với cá lớn lấy phần đầu hoặc não, mắt cắt thành những lát mỏng (0,5 cm) trước khi ngâm trong dung dịch cố định Formalin 10% ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10.

Phải dùng các dụng cụ vô trùng khi lấy mô ở các mẫu khác nhau để tránh lây nhiễm.

CHÚ Ý: Không dùng cá chết hoặc cá bảo quản đá để cắt mô.

Mẫu cố định trong formalin 10 % (3.3.1) khoảng từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu;

Sau đó chuyển sang cồn 70 %.

Lấy miếng tổ chức cố định trong formalin ra, cắt miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm cho vào khuôn nhựa (4.2.1).

Theo tiêu chuẩn trên thì đối với cá nhỏ lấy nguyên con, đối với cá lớn lấy phần đầu hoặc não, mắt cắt thành những lát mỏng (0,5 cm) trước khi ngâm trong dung dịch cố định Formalin 10% ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10.

Phải dùng các dụng cụ vô trùng khi lấy mô ở các mẫu khác nhau để tránh lây nhiễm.

Chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá bằng phương pháp nhuộm HE như thế nào?

Theo Phục lục E Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định cách tiến hành phương pháp nhuộm HE để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá như sau:

E.1 Xử lý mẫu

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm etanol 70 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 90 % (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 90 min;

Ngâm tẩm parafin (3.3.5) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 90 min;

Ngâm tẩm parafin (3.3.5) lần thứ hai, thời gian 120 min;

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2).

Đúc khuôn:

Sau đó, đưa mẫu vào khung đúc parafin: rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4) chuyên dụng;

Gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên;

Để nguội, tách lấy khối parafin.

E.2 Cắt tiêu bản

Cắt gọt khối parafin cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.2.5);

Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức;

Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 µm đến 5 µm;

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C;

Dùng lam kính (4.2.10) vớt dán lát cắt, chuyển sang máy sấy mẫu (4.2.13) có nhiệt độ 40°C trong 2 đến 3h.

E.3 Nhuộm tiêu bản Haematoxylin và Eosin

Tẩy parafin trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 100 % (3.1.1) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 90 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 70 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min;

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin (3.3.3) từ 3 min đến 5 min;

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong thuốc nhuộm từ Eosin (3.3.4) từ 3 min đến 5 min;

Loại bỏ nước còn bám trên phiến kính bằng cách:

Nhúng qua etanol 70 % (3.1.1) để từ 2 đến 3 min; sau đó nhúng qua etanol 100 % (3.1.1) 3 lần (3 cốc), mỗi lần để từ 2 đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần từ 2 min đến 3 min; Lau sạch xung quanh và gắn lamen (4.2.9) bằng keo dán.

Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.8).

Như vậy, cách tiến hành phương pháp nhuộm HE để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá được thực hiện theo Tiêu chuẩn nêu trên.