Sử dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn thì cần xử lý mẫu bệnh phẩm như thế nào?

Nội dung chính

• Sử dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn thì cần xử lý mẫu bệnh phẩm như thế nào?
• Khi áp dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn thì bước phản ứng của Nested PCR thực hiện ra sao?
• Có thể sử dụng những loại thuốc thử và vật liệu thử nào để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn?

Sử dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn thì cần xử lý mẫu bệnh phẩm như thế nào?

Sử dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn thì cần xử lý mẫu bệnh phẩm như thế nào? (Hình từ Internet)

Theo tiết 5.2.2.1 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-22:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn quy định về xử lý mẫu bệnh phẩm đối với phương pháp Nested PCR như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

5.2.2. Phản ứng Nested PCR (PCR lồng) xét nghiệm vi rút

5.2.2.1. Xử lý mẫu

Nghiền mẫu phủ tạng với dung dịch PBS (xem A.2 phụ lục A) có kháng sinh [hoặc môi trường nuôi cấy tế bào (xem 3.1) có kháng sinh (chất kháng sinh và kháng nấm)], ly tâm ở gia tốc 900 g (xem 4.1) trong 10 min, thu phần dịch nổi để xét nghiệm PCR. Đối với dịch ngoáy miệng hầu (mũi hoặc amidan) trong dung dịch bảo quản có kháng sinh, có thể sử dụng ngay để xét nghiệm.

...

Theo tiêu chuẩn trên, sau khi lấy được mẫu bệnh phẩm cần thiết để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn thì thực hiện nghiền mẫu phủ tạng với dung dịch PBS có kháng sinh [hoặc môi trường nuôi cấy tế bào có kháng sinh (chất kháng sinh và kháng nấm)], ly tâm ở gia tốc 900 g trong 10 min, thu phần dịch nổi để xét nghiệm PCR. Đối với dịch ngoáy miệng hầu (mũi hoặc amidan) trong dung dịch bảo quản có kháng sinh, có thể sử dụng ngay để xét nghiệm.

Khi áp dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn thì bước phản ứng của Nested PCR thực hiện ra sao?

Theo tiết 5.2.2.3 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-22:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn quy định về cách tách tiến hành phản ứng Nested PCR như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

5.2.2. Phản ứng Nested PCR (PCR lồng) xét nghiệm vi rút

...

5.2.2.1. Xử lý mẫu

Nghiền mẫu phủ tạng với dung dịch PBS (xem A.2 phụ lục A) có kháng sinh [hoặc môi trường nuôi cấy tế bào (xem 3.1) có kháng sinh (chất kháng sinh và kháng nấm)], ly tâm ở gia tốc 900 g (xem 4.1) trong 10 min, thu phần dịch nổi để xét nghiệm PCR. Đối với dịch ngoáy miệng hầu (mũi hoặc amidan) trong dung dịch bảo quản có kháng sinh, có thể sử dụng ngay để xét nghiệm.

5.2.2.2. Chiết tách ADN

Dùng kít chiết tách thương mại để chiết tách ADN của vi rút và theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục B).

5.2.2.3. Tiến hành phản ứng Nested PCR

Phương pháp Nested PCR bao gồm 2 lần thực hiện PCR thường với 2 cặp mồi khác nhau để phát hiện 1 đoạn gen đích. Trong đó sản phẩm PCR của lần thực hiện PCR thứ nhất dùng để làm khuôn mẫu cho lần thực hiện PCR thứ hai. Mục đích của sử dụng Nested PCR (2 lần thực hiện PCR) là để làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng hơn so với PCR thường (1 lần thực hiện PCR).

Phản ứng Nested PCR xét nghiệm vi rút giả dại trong quy trình này sử dụng các cặp mồi (xem 3.5) để phát hiện các đoạn gen đích thuộc gen B hoặc gen E trong Bảng 1.

Phương pháp Nested PCR sử dụng các cặp mồi phát hiện gen gE có thể phân biệt được vi rút thực địa và vi rút của vắc xin nhược độc được đánh dấu bằng xóa gen gE.

5.2.2.3.1. Hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt trong máy PCR (xem 4.9) có thể được thực hiện theo hướng dẫn kèm theo bộ kit sử dụng (xem C.1 phụ lục C).

5.2.2.3.2. Điện di sản phẩm PCR

Pha 1,5 g bột agarose với 100 ml 1xTAE, rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 °C đến 60 °C), cho tiếp 2 ml etidi bromua (10 mg/ml) vào. Sau đó đổ vào khay và cắm lược. Để gel cứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra.

Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bộ điện di (xem 4.10) đến vạch full level, đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di. Pha 2 ml dung dịch đệm tải mẫu (loading dye) với 4 ml dung dịch thang chuẩn (100 bp ladder) rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel. Pha 2 ml dung dịch đệm tải mẫu với 8 ml mẫu (đối chứng âm và dương) rồi dùng micropipet (xem 4.2) đưa vào các giếng còn lại của miếng gel.

Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 min đến 40 min.

5.2.2.3.3. Đọc kết quả

Đặt gel đã điện di vào máy chiếu tử ngoại (UV transilluminator) có bước sóng 590 nm.

Nếu sử dụng các cặp mồi phát hiện gen B, mẫu dương tính có hiển thị vạch sản phẩm giống như đối chứng dương và có kích thước 334 bp (lần PCR 1) và 195 bp (lần PCR 2), với điều kiện đối chứng âm không có vạch sản phẩm xuất hiện.

Tương tự, nếu sử dụng các cặp mồi phát hiện gen E, mẫu dương tính có hiển thị vạch sản phẩm giống như đối chứng dương và có trọng lượng 377 bp (lần PCR 1) và 211 bp (lần PCR 2).

Mẫu âm tính giống đối chứng âm và không có vạch sản phẩm xuất hiện.

Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm. Trường hợp này cần xét nghiệm lại hoặc sử dụng các phương pháp khác để khẳng định.

...

Như vậy, phản ứng Nested PCR trong phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Có thể sử dụng những loại thuốc thử và vật liệu thử nào để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-22:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn quy định về thuốc thử và vật liệu thử để chẩn đoán bệnh giả dại như sau:

Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

3.1. Môi trường nuôi cấy tế bào Minimum essential medium (MEM).

3.2. Môi trường nuôi dưỡng Eagle (EMEM)

3.3. Trypsin/ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 0,25 %

3.4. Huyết thanh thai bê (FCS) 5 % và FCS 10 %

3.5. Cặp mồi (xuôi và ngược), dùng để phát hiện vi rút PCV2.

...

Theo đó, thuốc thử và vật liệu thử để chẩn đoán bệnh giả dại ở lợn gồm:

- Môi trường nuôi cấy tế bào Minimum essential medium (MEM).

- Môi trường nuôi dưỡng Eagle (EMEM)

- Trypsin/ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 0,25 %

- Huyết thanh thai bê (FCS) 5 % và FCS 10 %

- Cặp mồi (xuôi và ngược), dùng để phát hiện vi rút PCV2.