Trong phương pháp Realtime PCR thì cần sử dụng cặp mồi nào để phát hiện virus ra gây bệnh herpesvirus trên cá chép?

Nội dung chính

• Áp dụng phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh herpesrirus trên cá chép thì cần dùng thuốc thử và vật liệu thử nào?
• Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realttime PCR để chẩn đoán bệnh herpesvirus gồm những loại nào?
• Trong phương pháp Realtime PCR thì cần sử dụng cặp mồi nào để phát hiện ra virus gây bệnh herpesvirus?

Áp dụng phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh herpesrirus trên cá chép thì cần dùng thuốc thử và vật liệu thử nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định về thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp Realtiem PCR như sau:

"3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có DNAse và RNAse, trừ khi có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho lấy mẫu

3.1.1 Cồn (Ethanol), từ 70% đến 100%;

3.1.2 Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem Phụ lục A);

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR;

3.2.1 Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;

3.2.2 Kít nhân gen PCR, realtime PCR;

3.2.3 Nước tinh khiết, không có DNAse và RNAse.

3.2.4 Bột agarose, dung dịch TBE 10X;

3.2.5 Chất nhuộm gel (ví dụ: GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

3.2.6 Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);

3.2.7 Thang chuẩn ADN;

3.2.8 Đoạn mồi (primers): thực hiện phản ứng PCR;

3.2.9 Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe): thực hiện phản ứng realtime PCR;

3.2.10 Mẫu đối chứng: Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa ADN của vi rút KHV được chiết tách từ mẫu dương chuẩn. Mẫu đối chứng âm là mẫu nước không có DNAse và RNAse dùng để pha loãng các chất phản ứng."

Theo đó, thuốc thử và vật liệu thử sử dụng khi áp dụng phương pháp Realtime PCR gồm:

- Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;

- Kít nhân gen PCR, realtime PCR;

- Nước tinh khiết, không có DNAse và RNAse.

- Bột agarose, dung dịch TBE 10X;

- Chất nhuộm gel;

- Dung dịch nạp mẫu;

- Thang chuẩn ADN;

- Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe);

- Mẫu đối chứng.

Trong phương pháp Realtime PCR thì cần sử dụng cặp mồi nào để phát hiện virus ra gây bệnh herpesvirus? (Hình từ Internet)

Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realttime PCR để chẩn đoán bệnh herpesvirus gồm những loại nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định về thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realtime PCR như sau:

"4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1 Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0 °C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3 Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

4.1.4 Máy nghiền mẫu hoặc cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, vô trùng;

4.1.5 Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

4.2 Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp PCR, realtime PCR

4.2.1 Máy nhân gen (PCR, realtime PCR);

4.2.2 Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

4.2.3 Máy lắc ủ nhiệt;

4.2.4 Máy spindown, máy ly tâm lắng;

4.2.5 Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

4.2.6 Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel.

Ngoài ra, còn có các loại đầu tip, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

Như vậy, khi dùng phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh herpesvirus trên cá chép thì cần sử dụng những thiết bị dụng cụ như:

- Máy nhân gen (PCR, realtime PCR);

- Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

- Máy lắc ủ nhiệt;

- Máy spindown, máy ly tâm lắng;

- Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

- Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel.

Bên cạnh đó còn có các loại đầu tip, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

Ngoài các thiết bị dụng cụ dùng riêng cho phương pháp Realtime PCR thì còn có các thiết bị dụng cụ dùng chung cho phương pháp chẩn đoán theoTTiêu chuẩn nêu trên.

Trong phương pháp Realtime PCR thì cần sử dụng cặp mồi nào để phát hiện ra virus gây bệnh herpesvirus?

Theo tiết 6.2.2 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định về cặp mồi sử dụng trong phương pháp Realtime PCR như sau

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện vi rút KHV

...

6.2.2 Phương pháp realtime PCR

...

6.2.2.2 Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục D.

Phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút KHV sử dụng mồi xuôi KHV 86f, mồi ngược KHV 163R và đoạn dò Taqman Probe KHV-109p (theo Gilad, 2004).

Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 20 μM và đoạn dò ở nồng độ 6 μM với nước tinh khiết không có DNAse/RNAse (4.2.3).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút KHV theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix- UDG 3), Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen.

..."

Từ quy định trên thì trong phương pháp realtime PCR khi thực hiện bước phản ứng realtime PCR để phát hiện vi rút KHV thì cần sử dụng mồi xuôi KHV 86f, mồi ngược KHV 163R và đoạn dò Taqman Probe KHV-109p (theo Gilad, 2004).

Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 20 μM và đoạn dò ở nồng độ 6 μM với nước tinh khiết không có DNAse/RNAse.